应变对间充质干细胞向成骨细胞分化的力学响应机制研究

论文摘要

目的：利用力学加载装置对小鼠骨髓间充质干细胞系（D1细胞）加载不同拉伸应变，探讨力学因素对干细胞向成骨细胞分化的影响及力学信号转导机制。 方法：在成骨细胞诱导体系条件下，D1细胞施加不同的拉伸应变后，采用免疫组化方法、RT-PCR技术、Flou-3-AM Ca2+染色方法及激光共聚焦技术。分析与成骨细胞分化有关的OSX（Osterx）、骨钙蛋白（Osteocalcin OCN）基因、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型胶原（type Ⅰ collagen，COLl）、OCN蛋白的表达；对细胞内ca2+水平及微丝结构进行考察；利用SB203580（p38MAPK特异抑制剂）、PD98059（MEK-1／2MAPK特异抑制剂）、LY294002（PI3KS特异抑制剂）、细胞松弛素B（微丝结构阻断剂）、EGTA(Ca2+螯合剂)信号阻断剂探讨力学信号传导的信号途径。 结果：间充质干细胞向成骨细胞分化过程中，拉伸应变能促进细胞ALP、Ⅰ型胶原、OCN蛋白的表达，激活与成骨细胞分化起关键作用的OSX、OCN基因；细胞受到应变作用时，骨架结构微丝发生断裂和重排，同时细胞生长方向发生相应改变；拉伸应变能促进干细胞内Ca2+水平的增加和钙火花的释放；力学信号的传导与磷酸化的磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol-3-kinases，PI3Ks）信号通路、细胞骨架结构微丝、细胞内Ca2+水平有密切关系。 结论：不同拉伸应变能促进间充质干细胞向成骨细胞分化；力学信号通过Ca2+信号、细胞微丝结构以及PI3Ks信号途径引起细胞的应答反应和生物学效应。

论文目录

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• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 研究的目的、意义
• 1.2 课题的提出
• 1.3 研究内容与研究方法
• 1.4 基本思路与逻辑结构
• 第二章 拉伸应变装置的设计及使用效果评价
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验仪器、器材
• 2.3 实验方法与结果
• 2.3.1 拉伸应变装置结构设计
• 2.3.2 基底拉伸应变分布有限元分析
• 2.3.3 拉伸应变装置的设计
• 2.3.4 应变拉伸装置系统运行初步评价
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第三章 干细胞向成骨细胞的定向诱导分化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 细胞
• 3.2.2 实验仪器、器材
• 3.2.3 主要试剂及配制方法
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 细胞培养
• 3.3.2 D1细胞诱导分化
• 3.3.3 矿化结节染色
• 3.3.4 免疫组织化学染色
• 3.3.5 总 RNA提取
• 3.3.6 RT-PCR反应
• 3.4 结果
• 3.4.1 MSCs向成骨细胞分化的细胞形态特征
• 3.4.2 MSCs向成骨细胞定向分化时成骨细胞特异性指标检测
• 3.4.3 MSCs向成骨细胞分化时成骨细胞特异性基因检测
• 3.5 讨论
• 3.6 结论
• 第四章 拉伸应变对干细胞向成骨细胞定向分化的影响
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 细胞
• 4.2.2 实验仪器、器材
• 4.2.3 主要试剂及配制方法
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 细胞培养
• 4.3.2 应变加载实验
• 4.3.3 免疫组织化学染色
• 4.3.4 总 RNA提取
• 4.3.5 RT-PCR反应
• 4.4 结果
• 4.4.1 拉伸应变对细胞形态结构的影响
• 4.4.2 拉伸应变对干细胞向成骨细胞分化的影响
• 4.4.3 拉伸应变对成骨细胞分化关键基因表达的影响
• 4.4.4 不同拉伸应变对成骨细胞分化关键基因表达的影响
• 4.5 讨论
• 4.6 结论
• 第五章 间充质干细胞细胞骨架对不同拉伸应变响应的研究
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 细胞
• 5.2.2 实验仪器、器材
• 5.2.3 主要试剂及配制方法
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 细胞培养
• 5.3.2 应变加载实验
• 5.3.3 样本制备
• 5.3.4 CLSM检测
• 5.3.5 考马斯亮蓝显示微丝结构
• 5.3.6 统计学分析
• 5.4 结果
• 5.4.1 3％拉伸应变对细胞排列方向及微丝结构的影响
• 5.4.2 不同拉伸应变对细胞排列方向的影响
• 5.5 讨论
• 5.6 结论
• 2+信号的影响'>第六章 应变对 MSCs向成骨细胞分化过程中Ca²⁺信号的影响
• 6.1 引言
• 6.2 实验材料
• 6.2.1 细胞
• 6.2.2 实验仪器、器材
• 6.2.3 主要试剂及配制方法
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 细胞培养
• 6.3.2 应变加载实验
• 6.3.3 钙离子的检测
• 6.3.4 统计学分析
• 6.4 结果
• 2+水平的变化'>6.4.1 拉伸应变作用不同时间后细胞 Ca²⁺水平的变化
• 2+水平的影响'>6.4.2 不同拉伸应变对细胞 Ca²⁺水平的影响
• 2+水平的影响'>6.4.3 微丝结构破坏后拉伸应变对细胞 Ca²⁺水平的影响
• 2+水平的影响'>6.4.4 EGTA对应变作用细胞后细胞内Ca²⁺水平的影响
• 2+火花的激发'>6.4.5 拉伸应变对 MSCs向成骨细胞分化过程中Ca²⁺火花的激发
• 6.5 讨论
• 6.6 结论
• 第七章 干细胞向成骨细胞分化时力学信号转导途径的研究
• 7.1 引言
• 7.2 实验材料
• 7.2.1 细胞
• 7.2.2 实验仪器、器材
• 7.2.3 主要试剂及配制方法
• 7.3 实验方法
• 7.3.1 细胞培养
• 7.3.2 应变加载实验
• 7.3.3 总 RNA提取
• 7.3.4 RT-PCR反应
• 7.4 结果
• 7.4.1 不同信号阻断剂对细胞形态结构的影响
• 7.4.2 阻断相关信号途径后应变对成骨细胞关键基因表达的影响
• 7.5 讨论
• 7.6 结论
• 第八章 全文总结
• 8.1 全文主要结论
• 8.2 本研究的特色和创新点
• 参考文献
• 附录一 缩略词索引表
• 附录二 攻读博士期间发表的科研论文
• 文献综述
• 致谢