水貂阿留申病毒VP2基因在伪狂犬病毒中表达

论文摘要

水貂阿留申病毒（Aleutian mink disease virus,ADV）是自主复制型细小病毒,主要侵害水貂的免疫细胞,导致机体免疫系统紊乱并逐渐衰竭,由ADV持续感染而引起水貂免疫系统性疾病称之为阿留申病（Aleutian disease, AD）。该病是目前危害世界养貂业的三大病毒性传染病之一。由于该病的特殊致病机理,对该病的免疫预防缺少有效的方法,研制开发针对AD的疫苗,一直是动物医学界很棘手的问题。VP2是ADV的重要结构蛋白,其在病毒衣壳粒中占有较大的比重,现研究己证明VP2蛋白有良好的抗原性,是抗原决定簇载体,是制备基因工程疫苗重要的候选保护性抗原。伪狂犬病毒（PRV）是近些年才被应用的一种表达载体,PRV具有宿主范围广、不感染人,若缺失主要毒力基因对动物也不致病,安全性较高,其分子背景也比较清楚，.可供外源基因插入或替代的非必需基因位点多,可插入的外源基因容量大,而且重组病毒的遗传特性稳定,因此PRV很适合于改造成病毒表达载体,已被国内外公认为可直接用于构建活载体疫苗。因此,以伪狂犬病毒作为载体表达其它病原的主要保护性抗原蛋白,构建重组伪狂犬病毒成为基因工程疫苗研究的热点之一。本研究利用PCR技术从水貂阿留申病毒中扩增出免疫原性良好的VP2基因,将其与克隆载体pMD18-T连接后,转化到E.coli JM109感受态中,经蓝白斑筛选,挑取阳性菌落,提取质粒,进行电泳,并进行PCR鉴定、酶切鉴定和序列测序鉴定,阳性质粒命名为pMD-VP2-1。然后根据所测得的基因序列,在原有引物的基础上加上SalI和BamHI两个酶切位点,重新克隆了VP2基因,所得的阳性重组质粒命名为pMD-VP2-2,然后对该质粒和转移载体pIESlacz分别用SalI和BamHI两个限制性内切酶进行酶切,经T4 DNA连接酶连接后获得携带水貂阿留申病毒VP2基因的转移载体质粒,命名为pIESZVP2,用脂质体介导将PRV和该载体一起转染vero细胞,构建含VP2基因的重组伪狂犬病毒,并利用LacZ筛选标记进行多次蓝色噬斑筛选和重组病毒纯化,再用PCR法和间接免疫荧光法鉴定重组病毒,结果表明成功构建重组病毒,且其表达的蛋白具有反应原性。用得到的重组伪狂犬病毒接种vero细胞,对基因表达产物进行SDS-PAGE分析,结果显示,在约80KDa处有目的条带出现,符合VP2基因序列表达蛋白大小。综上,本研究为制备用来防治水貂阿留申病和伪狂犬病的二价基因工程活载体疫苗打下了良好的基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 文献综述
• 综述一 水貂阿留申病毒的研究进展
• 1 水貂阿留申病毒概述
• 1.1 ADV的分类地位
• 1.2 ADV的生物学特性
• 1.3 ADV的分子生物学研究进展
• 2 水貂阿留申病概述
• 2.1 AD的流行情况
• 2.2 AD的发病机理
• 2.3 AD的临床症状与病理变化
• 2.4 AD的诊断与防治
• 3 结语
• 综述二 伪狂犬病及其病原学特性研究
• 1 伪狂犬病毒的基因组特点与感染的分子机制
• 1.1 基因组结构
• 1.2 PRV引起感染的分子机制
• 2 伪狂犬病毒编码的主要糖蛋白及其功能
• 3 伪狂犬病毒疫苗株研究进展
• 3.1 基因缺失型疫苗
• 3.2 伪狂犬病病毒活载体疫苗
• 4 伪狂犬病毒表达载体
• 4.1 伪狂犬病毒作为表达载体的优越性
• 4.2 重组伪狂犬病毒的构建
• 5 结语
• 第二部分 研究内容
• 实验一 水貂阿留申病毒VP2全基因的克隆与序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 水貂阿留申病毒VP2基因的PCR扩增结果
• 2.2 重组质粒PMD-VP2-1的电泳结果
• 2.3 重组质粒PMD-VP2-1的PCR鉴定结果
• 2.4 重组质粒PMD-VP2-1的酶切鉴定
• 2.5 重组质粒PMD-VP2-1测序结果
• 3 讨论
• 3.1 ADV感染流行情况
• 3.2 ADV的保护性抗原基因
• 3.3 关于ADVVP2基因的序列分析
• 4 小结
• 实验二 携带水貂阿留申病毒VP2基因的PRV转移载体的构建
• 1 材料
• 1.1 病毒和细胞
• 1.2 质粒和菌株
• 1.3 试剂
• 1.4 主要仪器
• 1.5 主要溶液
• 2 方法
• 2.1 水貂阿留申病毒VP2基因的克隆
• 2.2 携带水貂阿留申病毒VP2基因的PRV转移载体的构建
• 3 结果
• 3.1 VP2基因PCR扩增结果
• 3.2 重组质粒PMD-VP2-2的PCR鉴定
• 3.3 重组质粒PMD-VP2-2的双酶切鉴定结果
• 3.4 重组质粒PMD-VP2-2的序列测定
• 3.5 转移载体PIESZVP2的PCR
• 3.6 转移载体PIESZVP2的双酶切鉴定结果
• 3.7 转移载体PIESZVP2的序列测定
• 4 讨论
• 4.1 伪狂犬病病毒作为表达载体的优越性
• 4.2 本试验携带水貂阿留申病毒VP2基因的PRV转移载体的构建策略
• 5 小结
• 实验三 表达ADV VP2基因重组PRV病毒的筛选鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 重组病毒的的构建
• 2.2 PCR法鉴定重组病毒
• 2.3 重组伪狂犬病毒总蛋白的SDS-PAGE结果
• 2.4 重组伪狂犬病毒的间接免疫荧光法鉴定
• 3 讨论
• 3.1 重组伪狂犬病毒的构建
• 3.2 关于水貂阿留申病毒VP2基因的体外表达
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 附录1
• 附录2