AGO1影响肝细胞癌转移复发的机制及其预后价值的研究

论文摘要

原发性肝癌主要是肝细胞癌（以下简称肝癌）,其发病率位居全球恶性肿瘤发病率第5位,而肿瘤致死率则位居全球第3。目前,外科根治性切除是治疗肝癌的主要方法,但其术后高复发率和高转移率是阻碍肝癌患者获得长期生存的主要问题。因此探索新的有效生物指标来进行预后判断或者作为靶点发展新的辅助治疗手段,成为预防及治疗肝癌复发转移的重要研究方向。越来越多的研究已经显示微小RNA（microRNAs, miRNAs）可以通过RNA干扰（RNA interference, RNAi）途径调节很多细胞内的基因表达。其中有半数miRNAs位于较为脆弱的染色质位点以及那些经常在各种肿瘤内功能丢失或功能放大的区域,提示了这些niRNAs可能在肿瘤发生发展中起重要作用,他们也被称为肿瘤miRNAs （oncomiRs）。然而,虽然在肿瘤发生发展过程中抑制这些oncomiRs可以成为一种新型有效的肿瘤疗法,但由于每种oncomiR对于肿瘤发展所起的作用是各自独立的,因此在肿瘤细胞中同时抑制多种oncomiR是极为困难的。而AGO亚家族是Argonaute蛋白家族的两个亚家族（AGO和PIWI）之一,是RNAi机制的必需组成蛋白,同时也可以调节大多miRNAs的生物合成。这些蛋白出现在已被报道的所有RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complexes, RISC）中,并且被认为是在成熟miRNAs生物合成过程中的必需蛋白。作为RISC的主要成分蛋白,AGO1的研究较为深入,其与多种肿瘤的关系已经在近期多个研究中被报道。然而,在肝癌研究中仅有有限的关于AGO1的数据被报道且并未得出任何结论。因而,相比较单个niRNAs而言,探索AGO1和肝癌之间的联系可能是寻找肝癌有效预后指标和治疗靶点的一个更有希望的途径。因此我们对其进行了系统研究。我们利用RT-PCR和Western Blot方法检测人不同转移潜能肝癌细胞株HepG2、MHCC97L及HCCLM3内的AGO1表达情况,同时利用RT-PCR方法检测其在冰冻肝癌标本及相应癌旁组织标本内的表达情况,发现AGO1的表达随着肝癌细胞株转移潜能的增加而增加（P=0.014）,并且在肝癌组织内的表达显著高于其相应的癌旁组织（P<0.001）。为进一步探索AGO1在肝癌中所起的作用以及其可能的内在机制,我们设计并合成不同抑制效率的AGO1靶向siRNA:control siRNA、AGO1-2427和AGO1-2235,并将它们转染入HCCLM3与HepG2两种肝癌细胞株。在siRNA转入24h后,RT-PCR和Western Blot检测证实细胞内AGO1表达的抑制效率随control siRNA、AGO1-2427和AGO1-2235表现出显著提高的趋势,且三者之间有显著差异（P=0.003和P<0.001）。AGO1的下调造成细胞增殖功能在转染siRNA48h后出现显著抑制（P=0.039和P=0.014）。同样,在划痕实验与Transwell小室侵袭实验中,抑制AGO1表达也造成了肿瘤细胞迁移与侵袭能力的显著下降（均为P<0.001）。且在该两种细胞株功能实验中,细胞增殖、迁移与侵袭能力的抑制随着control siRNA、AGO1-2427和AGO1-2235表现出显著提高趋势。AGO1的下调也同样导致了该两种细胞株P53和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表达的显著下降（均为P<0.001）,且抑制趋势随着control siRNA、AGO1-2427和AGO1-2235表现出显著提高。这种趋势能够在24h时首先被观察到,但P值并不显著。P53表达抑制趋势在48h时最为显著。VEGF表达的变化趋势与P53相似,但抑制趋势最显著出现在72h。基于前期结果,我们构建了肝癌组织芯片（n=200）,利用免疫组织化学方法进行AGO1与CD31染色。通过CD31染色计算微血管密度（microvessel density,MVD）,评估其与AGO1表达的关系。同时探索AGO1与临床病理特征的相关性及其表达的预后价值。结果显示AGO1染色主要出现在肝癌组织及其癌旁组织的细胞质中,少部分为核染色。其在肿瘤组织中的表达阳性率为45.0%高于癌旁组织的27.0%。肿瘤组织内AGO1阳性染色的患者与年龄小（P=0.039）、甲胎蛋白（α-fetoprotein, AFP）高（P=0.002）、HBeAg阳性状态（P=0.049）、肝硬化（P=0.045）、肝内或肝外复发（P<0.001）和高MVD（P<0.001）等临床病理特征呈正相关。肿瘤组织内AGO1的表达是肝癌患者总体生存（P=0.008）与无瘤生存（P<0.001）的独立危险因素,其无瘤生存预测价值在早期复发（24个月内）与晚期复发（超过24个月）组（P=0.020和P<0.001）；AFP≤20ng/ml与>20ng/ml组（P=0.001和P=0.008）；肿瘤大小≤5cm与>5cm组（P=0.002和P=0.007）；HBsAg状态阳性与阴性组（P=0.005和P=0.002）等分组条件下依然存在。通过上述研究,我们可以得出结论,AGO1可能通过P53与VEGF通路来调控肝癌细胞的增殖、转移侵袭能力与肝癌组织内的新生血管生成过程,其在肝癌组织中的表达尚与患者的HBV感染状态等不良临床病理特征有关。AGO1有可能成为肝癌患者新的可靠预后指标及治疗靶点。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一部分：AGO1在肝癌细胞株和肝癌组织内的表达
• 摘要
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分：AGO1对肝癌细胞增殖、迁移与侵袭能力及P53与VEGF表达的影响
• 摘要
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分：AGO1与肝癌新生血管生成关系的验证及其预后价值的研究
• 摘要
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 文献综述 Argonaute蛋白家族与肿瘤的研究进展
• 参考文献
• 所获奖项
• 发表文章
• 致谢