重组逆转录病毒介导的k-Ras/c-Myc小鼠卵巢癌动物模型的建立和抑癌基因OPCML的克隆及其在卵巢癌中的功能研究

论文题目: 重组逆转录病毒介导的k-Ras/c-Myc小鼠卵巢癌动物模型的建立和抑癌基因OPCML的克隆及其在卵巢癌中的功能研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 肿瘤学

作者: 姚德生

导师: 李力

关键词: 逆转录病毒载体,慢病毒载体,卵巢癌,基因转移,移植瘤模型

文献来源: 广西医科大学

发表年度: 2005

论文摘要: [研究背景和目的]卵巢癌是妇科肿瘤当中死亡率最高的肿瘤,绝大部分是来源于卵巢表面上皮。由于缺少能早期发现的敏感高和特异强的方法,同时因为其对化疗药容易产生耐药,因而其预后仍然不理想。动物模型不但有助于我们了解各种各样影响肿瘤细胞生物学特性的因子,而且可以作为探讨新的干预手段的基础。来源于腹水和原发灶的卵巢癌细胞系被有效地广泛用来在体内外对卵巢癌的研究以及保持对化疗药的敏感、发现一些新的有效的治疗药物和手段。肿瘤的发生发展普遍被认为是多步骤、多阶段发生的,其中包括了癌基因的激活和抑癌基因的丢失。癌基因k-Ras 和c-Myc 在卵巢上皮癌中有很高的检出率,因而被认为可能参与了卵巢癌的发生和发展。为了明确k-Ras 和c-Myc 在卵巢癌的发生发展中的作用,我们使用重组的小鼠莫洛尼逆转录病毒转基因系统,将k-Ras 和c-Myc 单独和联合转导到小鼠正常的卵巢上皮细胞(MOSE),研究转基因后MOSE 的生物学特性的改变及其在动物体内成瘤的情况。OPCML 定位于人染色体11q25,在这个区域常常发现有杂合子的缺失(LOH)。OPCML 与肿瘤的关系目前了解不多,有人认为可能是一个抑癌基因。为了进一步了解OPCML 在卵巢癌中所扮演的角色,我们通过从正常组织中克隆OPCML 基因,利用慢病毒转基因系统,将OPCML 转导入卵巢癌细胞,研究转基因前后细胞生物学特性的变化,同时了解所建立的慢病毒转基因系统在转基因工程中的可行性和优点。[材料和方法](1) 用胰酶消化法从小鼠卵巢上分离收集MOSE,进行原代培养,建立了MOSE 细胞株,将正常的c-Myc 基因和突变的k-Ras 基因分别插入莫洛尼逆转录载体,构建了携带有c-Myc 基因和突变的k-Ras 基因的表达质粒:pLPC-mMyc 和pLHC-kRas。将pLPC-mMyc 和pLHC-kRas 分别转入嗜野生性

论文目录:

目录

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中文摘要

英文摘要

第一章 卵巢癌发病的生物学改变及分子机理(文献综述)

1. 卵巢上皮的生物学特征

2. 卵巢癌的细胞遗传学

2.1 染色体数目的改变

2.2 染色体结构改变

2.3 11号染色体与卵巢上皮癌

3 卵巢癌的分子遗传学

3.1 癌基因

3.1.1 ras 基因

(1) ras 基因结构与功能

(2) ras 基因活化机制

(3) ras 基因与卵巢癌

3.1.2 c-myc 基因

(1) c-myc 癌基因结构

(2) c-myc 基因的表达产物及功能

(3) c-myc 癌基因与卵巢癌

3.1.3 AKT2 基因

3.1.4 erbB 基因

(1) erbB 受体分类与结构

(2) erbB 的信号传递机制

(3) erbB 和卵巢肿瘤的关系

3.1.5 PIK3CA

3.2 抑癌基因

3.2.1 P53 基因

(1) P53 基因结构及表达

(2) P53 基因产物及功

(3) P53 的失活机理

(4) P53 突变与卵巢肿瘤

3.2.2 P16 基因

(1) P16 基因结构及表达

(2) P16 基因的表达产物及功能

(3) P16 基因与卵巢肿瘤

3.2.3 BRCA1 和BRCA2

3.2 4 PTEN 基因

3.2.5 nm23 基因

3.2.6 OPCML

(1) OPCML 基因的结构与生物学功能

(2) OPCML 基因对卵巢癌关系

4 生长因子与卵巢癌

4.1 生长因子的分类与作用途径

4.2 表皮生长因子

4.3 转化生长因子β

4.4 胰岛素样生长因子

4.5 血管内皮生长因子

4.6 血小板源性生长因子

4.7 成纤维细胞生长因子

5 卵巢癌发生的动物模型

5.1 自发性和非上皮性卵巢肿瘤动物模型

5.2 体外转化卵巢上皮细胞的移植瘤

5.3 人卵巢癌细胞异体移植瘤

5.4 生殖内分泌因素导致的卵巢肿瘤

(1) 排卵损伤诱发的卵巢癌

(2) 高促性腺激素学说

(3) 甾体类激素

5.5 生殖细胞缺乏或耗尽诱导卵巢肿瘤

5.6 环境因素致癌的动物模型

5.7 转基因鼠巢癌动物模型

(1) 转基因小鼠

(2) 重组病毒携带目的基因直接囊内注射

6 综述参考文献

第二章 重组逆转录病毒介导的k-Ras/c-Myc 转基因小鼠卵巢癌动物模型的建立

前言

第一部分 CD1 小白鼠卵巢上皮细胞(MOSE)株的建立

1 材料与与方法

1.1 动物来源

1.2 主要试剂

1.3 CD1 小白鼠卵巢上皮细胞的分离

1.4 CD1 小白鼠卵巢上皮细胞的鉴定

(1) 显微镜下细胞形态学特征

(2) 细胞免疫组织化学染色检测CK19

(3) 细胞免疫组织化学染色检测Vimentin

1.5 CD1 小白鼠卵巢上皮细胞的培养与筛选

2 结果

2.1 CD1 小白鼠卵巢上皮细胞的形态学特征

2.2 CD1小白鼠卵巢上皮细胞的CK-19及Vimentin免疫组化染色结果

3 小结

第二部分 pLPC-m Myc、pLHC-kRas 表达质粒的构建及鉴定

1 材料与方法

1.1 质粒与菌株

1.2 主要试剂与工具酶

1.3 主要仪器

1.4 质粒构建

1.4.1 pLPC-m Myc 质粒构建

1.4.1.1 构建步骤

1.4.1.2 pLPC-mMyc 质粒DNA 的制备

1.4.1.3 pLPC-m My质粒鉴定与序列测定

1.4.2 pLHC-kRas的构建

2 结果

2.1 pLPC-mMyc 表达质粒的构建及鉴定结果

(1) 酶切结果

(2) 测序结果

2.2 pLHC-kRas 表达质粒的构建及鉴定

(1) 酶切结果

(2) 测序结果

3 小结

第三部分 重组逆转录病毒介导的c-Myc 和k-Ras 基因在CD1 小白鼠卵巢上皮细胞的表达及其生物学行为改变

1 材料

1.1 包装细胞来源

1.2 主要试剂及试剂盒

1.3 主要仪器

2 方法

2.1 重组逆转录病毒的制备

2.2 筛选药物浓度的测定

2.3 携带c-Myc 和k-Ras 基因重组逆转录病毒感染CD1 小白鼠卵巢上皮细胞

2.3.1 表达c-Myc 的细胞系(Myc)的建立

2.3.2 表达k-Ras 的细胞系(Ras)的建立

2.3.3 表达k-Ras 和c-Myc 细胞系(RM)的建立

2.4 CD1 小白鼠卵巢上皮细胞c-Myc 和k-Ras 基因mRNA 转录的检测

2.4.1 细胞总 RNA 的抽提

2.4.2 逆转录

2.4.3 PCR

2.5 转基因CD1 小白鼠卵巢上皮细胞mMyc、k-Ras 及TsAg 基因蛋白表达检测(Western blot)

2.6 细胞增殖试验

2.7 软琼脂中克隆形成试验

2.8 细胞体外侵袭能力测定

2.9 统计学处理

3 结果

3.1 目的基因及其表达的检测

(1) RT-PCR 检测目的基因表达结果

(2) Western blot 检测目的基因蛋白质的表达结果

(3) TsAg 检测结果

3.2 转基因后细胞增殖能力的变化

3.3 克隆形成

3.4 细胞侵袭能力的变化

4 小结

第四部分 重组逆转录病毒介导的转基因小鼠卵巢癌动物模型的建立

1 材料与方法

1.1 动物来源及实验分组

1.2 细胞培养

1.3 体内成瘤试验

1.4 荷瘤鼠肿瘤组织病理学检查及c-Myc 和k-Ras 基因蛋白表达测定

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 各转基因组细胞在裸鼠体内成瘤比较

2.2 荷瘤鼠肿瘤组织病理形态学及腹水细胞学情况

2.3 荷瘤鼠肿瘤组织c-Myc 和k-Ras 基因蛋白表达情况

3 小结

第五部分 讨论

1 卵巢癌动物模型建立的意义

2 k-Ras 和c-Myc 诱导卵巢癌发的机理

3 本研究所建逆转录病毒介导的转基因小鼠卵巢癌动物模型的特点及价值

4 小结

第三章 抑癌基因 OPCML 的克隆及其在卵巢癌中功能的研究

前言

第一部分 OPCML基因的克隆及表达质粒构建

1 材料

1.1 组织来源

1.2 细胞来源及培养

1.3 质粒与菌种

1.4 主要试剂及工具酶

1.5 主要仪器

2 方法

2.1 从小鼠正常组织中克隆 OPCML 基因

2.1.1 克隆引物的设计

2.1.2 OPCML 基因的克隆

(1) 组织总RNA 的提取

(2) RT-PCR

(3) PCR

(4) 扩增目的基因片段的回收

2.1.3 OPCML 基因表达质粒pcDNA3-OPCML 的构建

(1) PCR 产物的磷酸化(插入片段)

(2) 载体的准备

(3) 将 OPCML 导入表达载体pcDNA3

2.1.4 pcDNA3-OPCML 的测序

2.1.5 pcDNA3-OPCML质粒DNA的制备

2.2 OPCML 基因表达的检测

(1) pcDNA3-OPCML 转染293T 细胞

(2) Western blot 检测 OPCML 蛋白表达

3 结果

(1) OPCML 测序结果

(2) 新构建的pcDNA3-OPCML 质粒结构图

(3) Western blot 检测OPCML 蛋白结果

4 小结

第二部分 OPCML 重组慢病毒转基因系统的构建

1 材料

1.1 细胞来源及培养

1.2 质粒与菌种

1.3 主要试剂、试剂盒及工具酶

1.4 主要仪器

2 方法

2.1 技术路线

2.2 pWPI-GFP 和pcDNA3-OPCML 质粒DNA 提取

(1) pcDNA3-OPCML 质粒 DNA 提取

(2) pWPI-GFP 质粒 DNA 提取

2.3 插入载体的制备

2.4 插入片段(OPCML)的制备

2.5 OPCML 与pWPI-GFP 的连结与转化

2.6 pWPI-OPCML 质粒的扩增、筛选与鉴定

2.7 pWPI-OPCML 质粒表达 GFP 的检测

2.8 pWPI-OPCML 质粒表达 OPCML 蛋白的检测

3 结果

(1) PCR 筛选pWPI-OPCML 阳性克隆结果

(2) 酶切鉴定正向插入和反向插入结果

(3) 新建慢病毒表达质粒pWPI-OPCML 结构图

(4) pWPI-OPCML 质粒GFP 和 OPCML 蛋白表达测定结果

4 小结

第三部分 OPCML 基因对卵巢上皮癌生物学行为影响的体内外实验研究

1 材料

1.1 卵巢上皮癌细胞系来源、培养及实验分组

1.2 动物来源、饲养及实验分组

1.3 质粒

1.4 主要试剂、试剂盒期

1.5 主要仪器

2 方法

2.1 携带OPCML 基因的重组慢病毒的制备

2.2 重组病毒介导 OPCML 基因导入靶细胞

2.3 卵巢上皮癌细胞系 OPCML 基因表达检测

2.3.1 基因转导效率的检测

(1) 标记荧光蛋白GFP 的检测

(2) FCM 检测 GFP 阳性细胞百分数

2.3.2 目的基因蛋白质 OPCML 表达的 Western blot 检测

2.4 OPCML 对卵巢上皮癌生物行为影响的体外实验

2.4.1 细胞增殖试验

2.4.2 细胞聚合力试验

2.4.3 细胞周期测定

2.5 OPCML 基因对卵巢上皮癌生物行为影响的体内实验

2.5.1 体内移植瘤形成试验

2.5.2 荧光显微镜检测移植瘤中 GFP 的表达

2.5.3 免疫组织化学检测移植瘤中 OPCML 蛋白质的表达

2.6 统计学处理

3 结果

3.1 包装细胞293T 中 GFP 检测结果

3.2 基因转导效率的检测结果

3.3 Western blot 检测目的基因蛋白 OPCML 卵巢癌细胞系中表达结果

3.4 OPCML 对细胞增殖能力的影响

3.5 OPCML 对细胞周期的影响

3.6 OPCML 对细胞聚合力影响

3.7 OPCML 对体内移植瘤生长抑制的影响

3.8 荧光显微镜检测移植瘤中 GFP 的表达结果

3.9 荷瘤鼠肿瘤组织病理学检查及免疫组化检测OPCML 蛋白表达结果

4 小结

第四部分 讨论

1 OPCML 基因的生物学功能及与恶性肿瘤的关系

2 OPCML 基因对卵巢上皮癌生物行为的影响

3 慢病毒载体系统介导的基因转导的价值与意义

小结

论文参考文献

发布时间: 2005-08-08

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标签：逆转录病毒载体论文;  慢病毒载体论文;  卵巢癌论文;  基因转移论文;  移植瘤模型论文;