枯草芽孢杆菌EB-28防治马铃薯晚疫病及其抗菌物质研究

论文摘要

由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的马铃薯晚疫病,是制约马铃薯生产的一种重要病害。本研究发现,枯草芽孢杆菌EB-28（Bacillus subtilis）具有作为生防菌株防治马铃薯晚疫病的潜力。枯草芽孢杆菌EB-28是由番茄植株中分离得到的对番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）具有抑菌作用的生防菌株。本研究分别测试了其菌悬液、无菌体培养液对马铃薯晚疫病菌游动孢子释放和孢子囊直接萌发的抑菌能力。结果显示,EB-28无菌体培养液对马铃薯晚疫病菌的游动孢子释放有强烈的抑制作用（抑菌率达到91.26%）,但对病菌孢子囊萌发几乎无抑制作用。通过在不同培养环境条件下,分别对EB-28菌株的菌量和其无菌体培养液对马铃薯晚疫病菌游动孢子释放的抑制率进行测定,明确了EB-28菌株的最适培养条件。在黑麦培养基中,30℃、180 rpm、48 h时,其菌量能够达到最高（108 cfu/mL）水平,同时其无菌体培养液对病菌游动孢子释放的抑制率也达到最高的90.30%。结果显示,最佳培养条件为30℃、pH 7、48 h。试验分别测试了EB-28菌悬液及无菌体培养液在离体叶片与盆栽马铃薯上对马铃薯晚疫病的防治效果。结果显示,EB-28菌悬液在盆栽植株试验中对马铃薯晚疫病的防效达到74.22%,显著高于其在离体叶片上的防效55.68%。同时,其无菌体培养液的防效也分别达到了61.80%（盆栽试验）和60.54%（离体叶片试验）。以抗生素标记的EB-28菌株回接到盆栽马铃薯叶片,测定其在马铃薯叶片上的定殖能力。实验结果显示,接种3 d时,EB-28的菌量呈上升趋势,并在第3 d达到最高（108 cfu/g）,15 d后,菌量下降到103 cfu/g水平。同时,EB-28菌株对马铃薯晚疫病的防效,也表现出与菌量增减趋势相同的变化。EB-28菌株无菌体培养液经硫酸铵沉淀收集得到其蛋白粗提液,其中经硫酸铵饱和度为30%-80%沉淀所得到的蛋白粗提液对马铃薯晚疫病菌游动孢子释放具有强烈的抑制作用。进一步研究显示:蛋白粗提液的抑菌活性在40℃条件下处理20 min后与对照相比无显著变化;经60、80、100℃处理后,抑菌活性降低,但经100℃处理20 min后,仍保持部分活性。在pH值为5-11范围内时,其抑菌活性略有变化,而当pH为4时,其活性全部丧失。蛋白粗提液经胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶k、部分有机溶剂和紫外线分别处理后,活性无显著变化。经SDS-PAGE不连续体系电泳,结果显示这一蛋白粗提液中含有多种成分。蛋白粗提液经DEAE52-cellulose层析柱阶段洗脱分离,得到6个洗脱峰（280 nm）,其中第4号峰具有抑菌活性。4号峰经Sephadex G-75凝胶过滤,仅得到一个洗脱峰,经SDS-PAGE电泳,结果显示该峰已达到电泳纯,且其蛋白质表观分子量为24.3 kDa。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 马铃薯生产概况
• 1.2 马铃薯晚疫病及其防治现状
• 1.3 植物内生菌与枯草芽孢杆菌
• 1.4 枯草芽孢杆菌的防病机制及其抗菌物质
• 1.5 抗菌物质的分离纯化
• 1.6 本研究目的与意义
• 2 材料和方法
• 2.1 供试材料
• 2.1.1 供试菌株及植物品种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 药品及耗材
• 2.1.4 仪器
• 2.1.5 不连续体系SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶溶液及电泳缓冲液
• 2.2 枯草芽孢杆菌EB-28 对马铃薯晚疫病菌的抑菌作用
• 2.2.1 EB-28 发酵液、菌悬液及无菌体培养液的制备
• 2.2.2 EB-28 对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制作用
• 2.2.3 EB-28 菌悬液及无菌体培养液对马铃薯晚疫病菌游动孢子释放的抑制作用
• 2.2.4 EB-28 无菌体培养液对马铃薯晚疫病菌孢子囊直接萌发的抑制作用
• 2.3 枯草芽孢杆菌EB-28 菌株培养条件优化
• 2.3.1 EB-28 无菌体培养液抑菌活性测定
• 2.3.2 EB-28 活菌量调查
• 2.3.3 EB-28 菌株培养条件优化
• 2.4 枯草芽孢杆菌EB-28 菌株在离体叶片及盆栽植株上对马铃薯晚疫病的防效测定
• 2.4.1 EB-28 发酵液、菌悬液及无菌体培养液的制备
• 2.4.2 离体叶片试验测试EB-28 菌株菌悬液及无菌体培养液对马铃薯晚疫病的防治作用
• 2.4.3 盆栽试验EB-28 菌悬液及无菌体培养液对马铃薯晚疫病的保护和治疗作用测定..
• 2.4.4 抗链霉素EB-28 菌株的培养制备
• 2.4.5 抗链霉素EB-28 菌株的再检出方法
• 2.4.6 EB-28 在马铃薯植株上的定殖及防治马铃薯晚疫病的持效时间
• 2.5 枯草芽孢杆菌EB-28 蛋白粗提液制备及其稳定性
• 2.5.1 EB-28 蛋白粗提液制备方法
• 2.5.2 不同饱和硫酸铵沉淀
• 2.5.3 蛋白粗提液稳定性测定
• 2.5.4 蛋白粗提液不连续体系SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
• 2.6 枯草芽孢杆菌EB-28 菌株抗菌物质的分离纯化
• 2.6.1 EB-28 蛋白粗提液样品的制备
• 2.6.2 抗菌物质的DEAE 52-Cellulose 柱层析分离
• 2.6.3 抗菌物质的Sephadex G-75 柱层析分离
• 2.6.4 不连续体系SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
• 3 结果与分析
• 3.1 枯草芽孢杆菌EB-28 对马铃薯晚疫病菌的抑菌作用
• 3.1.1 EB-28 对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制作用
• 3.1.2 EB-28 菌悬液及无菌体培养液对马铃薯晚疫病菌游动孢子释放的抑制作用
• 3.1.3 EB-28 无菌体培养液对马铃薯晚疫病菌孢子囊直接萌发的抑制作用
• 3.2 枯草芽孢杆菌EB-28 菌株培养条件的优化
• 3.2.1 不同接种量的影响
• 3.2.2 不同通气量的影响
• 3.2.3 不同培养温度的影响
• 3.2.4 不同初始pH 值的影响
• 3.2.5 不同培养时间的影响
• 3.3 枯草芽孢杆菌EB-28 菌株在离体叶片及盆栽植株上对马铃薯晚疫病的防治
• 3.3.1 离体叶片试验测试EB-28 菌悬液及无菌体培养液对马铃薯晚疫病的防治作用
• 3.3.2 盆栽试验测定EB-28 菌悬液及无菌体培养液对马铃薯晚疫病的保护和治疗作用
• 3.3.3 EB-28 菌株在马铃薯植株上的定殖及防治马铃薯晚疫病的持效时间
• 3.4 枯草芽孢杆菌EB-28 蛋白粗提液制备及其稳定性研究
• 3.4.1 不同饱和度硫酸铵沉淀的抑菌效果
• 3.4.2 EB-28 蛋白粗提液稳定性测定
• 3.4.3 蛋白粗提液SDS-PAGE 不连续体系电泳结果
• 3.5 枯草芽孢杆菌EB-28 抗菌物质的分离纯化
• 3.5.1 抗菌物质的DEAE52-Cellulose 柱层析分离
• 3.5.2 抗菌物质的Sephadex G-75 柱层析分离
• 3.5.3 抗菌物质的SDS-PAGE 不连续体系电泳
• 4 讨论
• 4.1 EB-28 菌株对马铃薯晚疫病的抑菌作用
• 4.2 EB-28 菌株的培养条件
• 4.3 EB-28 菌株对马铃薯晚疫病的防治作用机制
• 4.4 EB-28 菌株在马铃薯植株上的定殖及防治持效期
• 4.5 EB-28 抗菌物质
• 4.6 EB-28 菌株防治马铃薯晚疫病的研究展望
• 5 结论
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简介
• 致谢