论文摘要
目的:通过制做坐骨神经缺损模型,将种植雪旺细胞的去细胞同种异体神经复合体移植桥接于坐骨神经缺损断端。观察神经-肌结构重建和功能恢复过程。探讨种植雪旺细胞的去细胞同种异体神经移植促进神经-肌结构重建和功能恢复的作用和机制,从而为临床上更加合理的治疗周围神经缺损提供理论依据。方法:1.细胞培养:取怀孕28天的新西兰白兔,耳缘静脉注入空气处死后迅速取胎兔。在手术显微镜无菌条件取坐骨神经,尽量去除神经外膜及束膜。Hank’s液冲洗5遍后将神经剪碎。使用双酶消化法（trypsin/collagenase）培养雪旺细胞,培养过程中利用双差速贴壁法及Arab-C（终末浓度10-5 mmol/L）去除和抑制成纤维细胞后,使用NGF（40ng/ml）促进SC细胞生长。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况并接种进行传代,收集生长良好的第二代细胞计数并应用S-100蛋白免疫组化鉴定。2.去细胞同种异体神经移植物制备:取成年健康新西兰白兔,分别于梨状肌下缘水平以远切取双侧坐骨神经,作为异体神经的来源。神经萃取前先在手术显微镜下去除表面的脂肪组织及部分神经外膜,置于4℃蒸馏水中静置6h,再将神经段放入3% Triton-X100溶液中静置12h,然后置于蒸馏水中震荡,漂洗6h。如此反复, Triton-X100共作用时间为96 h, 4℃下保存,用于神经移植。对萃取的神经段行石蜡切片HE染色及扫描电镜观察去细胞的情况。3.种植雪旺细胞的同种异体神经复合体修复兔坐骨神经缺损促进神经-肌结构重建与功能恢复的实验观察:将培养的第二代雪旺细胞以1×108/ml的浓度用100ul的微量注射器注射入去细胞神经段内,形成同种异体神经复合体,然后将此复合体迅速移植到兔缺损的一侧坐骨神经（实验组）,对照组移植未注入雪旺氏细胞的去细胞同种异体神经,术后4周,8周,16周大体观察兔的足部溃疡形成及愈合情况,肉眼观察神经愈合情况及靶肌肉形态变化。两组动物4,8,16周取材前行肌电图检查,取材后测量胫骨前肌湿重并行光镜和透射电镜观察。肌电图检查桥接段坐骨神经的潜伏期及传导速度;光镜观察桥接段远端的腓神经的有髓纤维数目,髓鞘,轴索,结缔组织及血管再生情况及所支配的胫骨前肌肌纤维和运动终板结构形态改变;电镜观察神经髓鞘,轴索,线粒体,微管,微丝,雪旺细胞等超微结构的变化。结果: 1.雪旺细胞的培养与观察:经传代的雪旺细胞在倒置相差显微镜下计数并观察细胞形态:雪旺细胞的浓度已达到1×108/ml,其典型形态呈梭形,有突起,多为双极,偶见三个细胞突起。胞核明显,呈卵圆形。细胞呈端对端、肩并肩、漩涡状或栅栏样排列生长。视野内仍可见少量成纤维细胞,胞体较雪旺细胞大,扁平状外形不规则,突起短而多,核仁明显,有2-3个核仁,颜色较雪旺细胞浅。2.去细胞神经桥接体的观察:大体观察:神经萃取过程中可见两端及周围有絮状物析出,萃取后神经呈淡乳白色,无光泽,其外径及长度较新鲜神经稍减小,柔软,有韧性。HE染色观察:神经纤维结构消失,红染的神经内膜呈波浪状纵形排列,形成管柱状空隙。扫描电镜观察:神经内的轴突、髓鞘已被完全去除,可见由胶原纤维构成的立体管状结构,部分管腔不规则。胶原纤维仍维持原有的位置、形态及结构特征,管内并可见膜样结构,为雪旺细胞基底膜。3.种植雪旺细胞的同种异体神经复合体修复兔坐骨神经缺损促进神经-肌结构重建与功能恢复的实验观察:术后4周、8周、16周两组动物手术区局部均未出现明显的排斥反应,实验组足部溃疡愈合情况、神经纤维数目、髓鞘及再生神经的超微结构,运动终板的形态及靶肌肉结构的恢复均优于对照组。神经传导速度（NCV）于术后4周时,两组均未见明显的神经传导,术后8周、16周实验组优于对照组。胫骨前肌湿重于术后4周实验组与对照组无明显差异,术后8周、16周实验组恢复优于对照组。结论:1.采用双酶消化法和双差速贴壁法培养和提纯雪旺细胞并辅以神经生长因子（NGF）可获取足够浓度的雪旺细胞。2.用3﹪Triton X-100作用96小时后可去除周围神经中的细胞和髓鞘而保留完整的基底膜管和纤维支架结构。3.种植雪旺细胞的去细胞同种异体神经复合体不仅能够能为再生神经提供良好的支架作用,又能够诱导和促进神经轴突和髓鞘的再生,对坐骨神经缺损后的神经-肌结构重建与功能恢复有更加有效的促进作用。
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标签：去细胞同种异体神经论文; 雪旺细胞论文; 坐骨神经论文; 组织工程论文; 运动终板论文;