论文摘要
苯丙烷及其分支途径产生大量具有生物重要性的次生代谢物质。其中一条分支途径合成木质素,对于高等植物的机械支撑、维管传导以及抗病性具有重要作用,另一条分支途径合成各种类黄酮物质,它们除吸引传粉昆虫和保护植物不受紫外线伤害外,而且对人还具有抗炎、抗过敏和防癌的功效。苯丙烷途径还参与合成芥子酸脂、香豆素、绿原酸、芪以及水杨酸等物质,作为植物的拮抗物质或信号分子。因此,对苯丙烷代谢途径的操作一直是一个研究热点。AtMYB4是一个R2R3-MYB家族转录抑制因子,它至少能抑制苯丙烷途径C4H基因的表达。在缺乏紫外线的条件下AtMYB4能够负调节芥子酸脂的形成。因此,通过对转录因子MYB4进行遗传操作,能够深入植物次生代谢调控机制的研究。甘蓝型油菜（Brassica napus）、白菜（B.rapa）和甘蓝（B.oleracea）是重要的世界性的油料作物或园艺作物,在它们中间有许多与苯丙烷途径相关的农艺性状长期是研究人员致力于遗传改良的焦点。比如,经常发生的倒伏问题要求更加强壮的茎和分枝,抗病性的提高要求更快和更高水平的受病原菌入侵而诱导的细胞壁木质化,而对木质素途径的流和强度以及不同木质素成份比例的遗传改良是解决该问题的一个重要保障。近年来油菜尤其是甘蓝型油菜的黄籽性状由于其优质特性而吸引了越来越多的研究人员,但是黄籽基因型的缺乏以及黄籽材料表现型的不稳定大大阻碍了黄籽油菜的育种与应用,黄籽性状的形成的分子机制不清楚。黄籽性状的最典型特征是种皮木质素和种皮色素的减少,业已证明种皮色素是原花青素的聚合物,原花青素是类黄酮途径的代谢产物,克隆芸薹属MYB4基因并进行种皮特异性的表达有可能修饰油菜种皮色素和种皮木质素性状。在十字花科,除了已经克隆的拟南芥（Arabidopsis thaliana）MYB4基因（AtMYB4）外,并无其它的全长MYB4基因被克隆,尽管该科中有许多重要的园艺和油料作物。本文报道了双二倍体物种甘蓝型油菜及其二倍体亲本物种甘蓝和白菜中MYB4基因家族的克隆、分子分析和比较基因组学研究。本研究克隆了甘蓝型油菜MYB4基因家族（BnMYB4）的3个成员、白菜型油菜MYB4基因家族（BrMYB4）的4个成员和甘蓝MYB4基因家族（BoMYB4）的2个成员的cDNA序列及其基因组全长序列,并进行了系统分析,主要结果如下:1)克隆了甘蓝型油菜及其2个亲本物种的MYB4基因家族本研究利用RACE技术,获得了甘监型油菜及其亲本物种白菜型油菜和甘监的MYB4基因家族部分成员全长cDNA和对应的基因组序列。BnMYB4-1,BnMYB4-2和BnMYB4-3基因分别为1393、1364和1405 bp,它们的mRNA分别为1271、1219和1253 bp（不计poly（A）尾巴,下同）;BrMYB4-1和BrMYB4-2的mRNA分别为1280和1223 bp。BrMYB4-3和BrMYB4-4基因分别为1407和1370bp,它们的mRNA分别为1278和1224 bp。BoMYB4-1 mRNA序列为1005bp。BoMYB4-2基因为1421 bp,其mRNA为1275 bp。为深入研究芸薹属植物MYB4基因的功能、进化、调控模式奠定了基础。2)芸薹属MYB4基因成员具有与AtMYB4相似的基因和蛋白特征芸薹属9个MYB4基因都有1个内含子和2个外显子,符合GT……AG的内含子边界序列特征,并且和AtMYB4的位置相符。在BnMYB4-1、BnMYB4-2、BnMYB4-3、BrMYB4-1、BrMYB4-2、BrMYB4-3、BrMYB4-4、BoMYB4-1和BoMYB4-2 mRNA的250～1133、165～1076、231～1079、249～1136、232～1083、249～1133、232～1083、47～938、279～1190bp区段有分别为一个885、915、852、888、852、885、852、885、912bp的开放阅读框（ORF,包括终止密码子）,它们的5’UTR分别为248、164、230、248、231、248、231、46、278bp,3’UTR分别为138、140、171、144、140、139、141、68、85bp。推导的BnMYB4-1、BnMYB4-2、BnMYB4-3、BrMYB4-1、BrMYB4-2、BrMYB4-3、BrMYB4-4、BoMYB41和BoMYB4-2蛋白分别为294、304、283、294、283、294、283、294和303个氨基酸残基,理论分子量（Mw）分别为33.10、34.37、31.65、33.10、31.65、33.07、31.66、33.12和34.27,等电点（pI）分别为8.78、9.13、8.61、8.78、8.61、8.79、8.73、8.88和9.13,都为碱性蛋白。它们都有较多的潜在的磷酸化位点,BnMYB4-1和BrMYB4-1有19个,BnMYB4-2和BoMYB4-2有23个,BnMYB4-3、BrMYB4-2和BrMYB4-3有18个,BrMYB4-4有21个,BoMYB4-1有17个。预测它们均没有信号肽和跨膜域,它们可能定位于细胞核。芸薹属3个物种的9个MYB4蛋白与AtMYB4一样,在它们的C-端域有2段保守的序列:C1保守域具有保守性基序LsrGIDPxT/SHPI/L,C2保守域具有保守性基序pdLNLD/ELXIG/S。因此芸薹属3个物种的9个MYIM蛋白按同源性应属于拟南芥MYB超家家族的第四亚类,并且应该与AtMYB4有类似功能,即以负调控因子的形式参与苯丙烷途径相关基因的调控。它们的二级结构非常相似,以随机卷曲所占比例最高,占氨基酸总数的47.85～56.80%;其次是α-螺旋,分别占氨基酸总数占25.17～32.67%,有少量的延伸链和β转角。它们蛋白的每个MYB结构域中都有5～7个大的α-螺旋,C末端也有1个。它们的三级结构也很相似,都只预测出了N-端的R2R3-MYB结构域的蛋白模型,而C-端尚没有匹配的模型。从基因结构、蛋白结构、序列同源性三大方面分析,均显示芸薹属3个物种的9个MYB4基因是AtMYB4的垂直同源基因。3)白菜型油菜/甘蓝与甘蓝型油菜间在基因水平的授受关系BnMYB4-1和BrMYB4-1之间编码区序列的一致性高达100%。BnMYB4-3和BrMYB4-2之间编码区序列的一致性高达100%。这些种间基因的一致性高于甘监型油菜种内成员之间的一致性。无论核酸水平还是氨基酸水平的系统发生学聚类结果,内含子的相似度,基因序列和氨基酸序列上的特异位点均显示,BnMYB4-1和BrMYB4-1;BnMYB4-3和BrMYB4-2:BnMYB4-2和BoMYB4-2紧密地聚在一起,可以确定BnMYB4-1、BnMYB4-2、BnMYB4-3分别来自于BrMYB4-1、BrMYB4-2、BoMYB4-2。因此,甘蓝和白菜型油菜的确为甘监型油菜提供了遗传物质。本研究从编码MYB4转录因子基因家族成员的全长序列比较克隆的角度,为揭示甘蓝型油菜与其亲本物种间的进化关系提供了直观而具体的分子证据。4)甘蓝型油菜、白菜型油菜和甘蓝MYB4基因家族的成员数及相对于拟南芥的“三倍化”采用羽衣甘蓝（Brassica oleracea var.acephala L.ftricolor Hort.）的一个典型黑籽系、白菜型油菜（Brassica rapa ssp.oleifera）的一个典型黑籽系的基因组总DNA为材料,分别用DraI、EcoRI和EcoRV这3种限制性内切酶进行酶切和Southern blot杂交,结果显示BrMYB4家族可能存在4个成员,BoMYB4基因家族可能存在3个成员。Southern blot杂交和基因克隆的结果表明,芸薹属二倍体基因种相对于拟南芥,在MYB4位点上的确发生了“三倍化”。甘蓝型油菜的MYB4基因尚没有进行Southern杂交,BnMYB4家族和BnMYB4家族目前也分别只克隆了3个和2个成员,因此还需要深入研究。5)构建了BrMYB4基因家族正义植物表达载体和共抑制BnMYB4、BrMYB4和BoMYB4基因家族的反义植物表达载体将BrMYB4基因家族4个成员的全长基因片段构建到中间载体pcambia2301G中,替换其上面的GUS基因,由CaMV35S启动子驱动,形成了BrMYB4基因成员的植物表达载体,分别命名为pCBrMYB4-1、pCBrMYB4-2、pCBrMYB4-3和pCBrMYB4-4。将BnMYB4、BrMYB4和BoMYB4基因家族共保守的465bp的反义片段构建到中间载体pCambia2301G中,替换其上面的GUS基因,由CaMV35S启动子驱动,形成了反义共抑制三物种所有成员的植物表达载体,命名为p2301G-MYB4A。这些植物表达载体的构建,为通过转基因验证芸薹属MYB4基因家族的功能和修饰相应的性状奠定了基础。