论文摘要
研究背景及目的标记免疫学,就是将标记技术和免疫学技术相结合进行分析测定的一门学科,是集基础医学、实验技术和临床应用于一体的学科,其基本原理是利用抗原抗体反应的高度特异性和各标记物的高灵敏可测量性来检查体内各种生物活性物质的活性和浓度。随着标记技术、单克隆抗体技术和分了生物学技术的不断发展与完善,标记免疫学已广泛应用于医学、农业、环境及食品检测等多个领域。目前该方法包括一系列的免疫分析技术：荧光免疫分析（FIA）、放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、胶体金免疫分析（GICA）、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）、化学发光免疫分析（CLIA）等。这些传统标记免疫学技术在应用中存在着一些不足：EIA酶容易失活,导致EIA的灵敏度不高,被标记物的空间结构易受到酶的大分子标记影响,使得EIA灵敏度的提高受到限制；TRFIA测量方式复杂,仪器成本及维修费用高,环境及样品巾同位元素可导致本底受到干扰；CLIA影响因素较多,例如发光时间短,易受环境干扰,化学反应后样品只可检测一次,无法重复测量,并且为非开放性试剂,试剂价格昂贵；而且,EIA、CLIA（?）（?）TRFIA等均以微孔板为反应载体,需要洗涤来分离结合标记与游离标记,整个操作过程步骤多、周期长、样品消耗大、不易自动化等缺点。因此,开发新型标记免疫技术非常有必要,一种新型定量免疫分析技术光激化学发光免疫分析（Amplified luminescent proximity homogenous immunoassay, AlphaLISA）技术应运而生。该技术起源于1994年发明的单线态氧分子能量传递发光免疫分析技术（Luminescent oxygen channeling immunoassay, LOCI）,随后美国PerkinElmer公司研制相关科研试剂（AlphaScreen（?））。作为近年兴起的新型定量均相免疫学检测技术,它克服了传统标记免疫学技术需洗涤分离结合标记与游离标记的缺点。它结合单线态氧半衰期短、纳米材料和激光技术等优势,实现了在均相中进行反应的操作过程。光激化学发光免疫分析技术具有操作简单、背景信号低、检测重复性好、无放射性污染、不需分离结合标记与游离标记、高通量、易于自动化和高灵敏度等优势,代表了现在及未来分析检测技术的发展趋势。人促卵泡激素（human follicle-stimulating hormone, hFSH）由垂体前叶分泌,为单链多肽激素。hFSH的增高多见于原发性睾丸衰竭、睾丸精原细胞瘤、先天性睾丸发育不全、先天性卵巢发育不全、原发性闭经、原发性性腺功能低下、更年期综合征；其降低常见于女性不孕症,长期服用避孕药,大量应用性激素等。因此定量检测血清中hFSH的浓度对临床疾病的诊断有重要意义。人促黄体生成素（human luteinizing hormone, hLH）为垂体前叶嗜碱性细胞所分泌的激素,为糖蛋白,分子量约为30000道尔顿。hLH分子由两条非共价连接的不同肽链（α和β）组成,α链与人促甲状腺激素（hTSH）,人促卵泡激素（hFSH）及人绒毛膜促性腺激素（hCG）相似,但β链的氨基酸顺序和组成不同,使其具有特异性,决定（?）LH的生物活性。对于女性来说,hLH的急速上升和急速变化,可促使排卵并形成黄体；对于男性来说,hLH也叫做促间质细胞激素,主要是促进睾丸间质细胞增生,促进睾酮的合成与分泌。在健康月经周期女性中,hLH浓度变化受排卵周期的影响,因此测定血清中hLH浓度可以预测女性排卵状况。此外,hLH的浓度变化和体内很多疾病的发生也有直接的联系,定量检测出血清中hLH的浓度对临床疾病的诊断有重要意义。本研究采用光激化学发光免疫分析（AlphaLISA）技术研制hFSH和hLH定量检测试剂,评价各项性能指标,并与其它检测试剂盒进行比较,评价其在临床检测应用巾的可行性。方法：采用双抗体夹心法研制人促卵泡释放激素和黄体生成素光激化学发光免疫分析试剂。1.参考标准品的配备用标准品缓冲液（50mmol/L Tris-HCl、7.5%BSA、0.9%NaCl、0.05%NaN3、0.01%Tween-20,pH7.8）将hFSH抗原配制成0,1,4,16,64,192U/L系列参考标准溶液;将hLH抗原至浓度分别为0,0.55,2.2,11,66,135U/L系列浓度,每瓶1ml分装冻干4℃保存备用。2.受体微球与抗体连接将0.2mg包被抗体加入到带有滤膜的离心管中,以5510g离心5-6min,用标记缓冲液（0.13mol/L, pH8.0PBS）重复洗涤6次后,在抗体溶液中加入1mg受体微球、10μL25mg/mL NaBH3CN：用标记缓冲液配制)、1.25μL10%Tween-20,用标记缓冲液将体积补充到200μL,37℃避光振荡反应48h。加入10μL65mg/mL CMO用0.8mol/LNaOH配制)封闭未结合位点,37℃避光温育1h后离心洗涤,得到已连接抗体的受体微球,调整受体微球浓度为5mg/mL。3.生物素与抗体连接将1mg标记抗体加入到带有滤膜的离心管中,以5510g离心5-6min。用标记缓冲液（0.1mol/L、Na2CO3/NaHCO3, pH9.5）重复洗涤6次后,在50u L抗体溶液中加入5μL22mg/mL活化生物素[用二甲亚砜（DMSO）配制],室温避光振动孵育4h。利用PBS（pH7.4）4℃透析24h,每6h换液一次,收集透析袋中液体,并将其抗体浓度调整为0.5mg/mL4.试剂性能指标的评价4.1准确度实验：试剂参考标准品用相应浓度的国家标准品进行多次分析测定,并以hFSH/hLH国家标准品为对照品,并以自制标准品的实测浓度与标示浓度的比值在0.90-1.10之间作为评价准确性合格的标准。4.2标准曲线的绘制：以自制试剂巾参考标准品浓度的对数为横坐标,信号值1×103计数的对数为纵坐标,由双对数数学模型Log-Log函数处理。4.3标准曲线工作范围及灵敏度：将零值参考标准品当作样品测量20次,计算其均值及标准差。以其测定值的均值加上2倍标准差所得信号值减去本底信号值,代入标准曲线方程计算所得出的浓度,即为其灵敏度。4.4Hook效应：对浓度递增的多个参考标准品抗原进行测定。4.5精密度实验：采用低、中、高3个质控品（质控品Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ）进行测定,得到各质控品检测值的均数、标准差及变异系数（CV）。4.6特异性实验：将一定浓度的干扰物质作为样本检测得到的相应浓度即为特异性。4.7回收率实验：在已知的5个浓度的血清样本中添加不同浓度的纯抗原,计算其理论值及实测值的比值,即回收率。4.8干扰实验：对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的阳性标本进行测定,计算其回收率。4.9与国外试剂的比较实验：样本用自制试剂与对照试剂检测后将所测浓度值进行配对非参数秩和检验及相关性分析。结果：以国家标准品为对照品,试剂参考标准品实测浓度与标示浓度的比值在0.90-1.10之间；自制hFSH试剂灵敏度为0.09U/L,标准曲线工作范围为0.09-192U/L；试剂分析内变异系数为4.2%-7.1%,分析间变异系数为7.5%-8.3%；与人黄体生成素（hLH）、人促甲状腺素（hTSH）和绒毛膜促性腺激素（hCG）无交叉反应；检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰；将100份血清标本用本试剂与西门了化学发光试剂同时检测,配对非参数秩和检验结果如下：Z=-0.825,P=0.409>0.05,表明两试剂在检测hFSH浓度值上无统计学差异；进行相关性分析,其相关系数（r）为0.993,P<0.0001。自制hLH试剂灵敏度为0.05U/L,标准曲线工作范围为0.05-135U/L；试剂分析内变异系数为4.3%-6.1%,分析间变异系数为7.4%-8.1%；与人促卵泡释放激素（hFSH）、人促甲状腺素（hTSH）和绒毛膜促性腺激素（hCG）无交叉反应；检测血清样本时不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰；将158份血清标本用本试剂与国外罗氏电化学发光试剂同时检测,进行配对非参数秩和检验,结果显示：Z=-1.295,P=0.195>0.05,表明两试剂在检测血清中hLH值上无统计学差异；进行相关性分析,其相关系数（r）为0.998,P<0.0001。结论：上述结果表明本研究研制的人促卵泡释放激素和黄体生成素光激化学发光免疫分析试剂的各项指标（准确性、灵敏度、精密度、特异性等）均达到临床检测试剂要求,有望替代国外昂贵试剂应用于临床检测和基础医学的研究。
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标签：光激化学发光免疫分析论文; 人促卵泡释放激素论文; 人促黄体生成素论文; 免疫分析论文;