新型信号放大型DNA分子机器的研究及应用

论文摘要

随着分子生物学的发展,围绕DNA这一生命遗传物质的研究成为了生命科学和材料科学研究的热点之一。本文将纳米技术和DNA分子机器技术相结合,探索高灵敏度生物分析新方法。结果表明,所建立的检测方法灵敏度高,易制作、简便,在生物分析中将具有广阔的应用前景。本文主要开展了以下几个方面的工作:一、高灵敏的基于一对一识别靶DNA的三胶体金/硫化铜纳米粒子探针的电化学DNA传感器设计了一对一识别靶DNA的三胶体金/硫化铜纳米粒子探针,并构建了高灵敏的电化学DNA传感器。该三胶体金/硫化铜纳米粒子探针是采用两条中间部分杂交互补DNA链形成桥型DNA骨架结构,将修饰了DNA的纳米金与桥型DNA骨架结构杂交,形成三端含有纳米金而一端留有靶DNA识别序列的探针结构,然后在纳米金上通过DNA连接大量的硫化铜纳米粒子标记物。利用该探针构建了基于夹心式杂交识别的电化学DNA传感器,即首先将捕获DNA固定于磁珠上,靶DNA的一端可与捕获DNA杂交进而连接到磁珠上,另一端与三胶体金/硫化铜纳米粒子探针杂交,形成夹心式结构。用硝酸溶液溶解探针获得相对浓度的Cu2+溶液,用灵敏的差分脉冲伏安法（DPASV）对Cu2+进行检测。该电化学DNA传感器的优点:探针的一对一识别提高灵敏度,每个探针上有三个金纳米粒子,可以使信号放大,检测中Cu2+预富集再此放大响应信号。在优化的实验条件下,检测靶DNA的线性范围是1×10-14mol/L1×10-12mol/L,检测限可达3.8×10-15 mol/L（3σ）。两碱基错配选择性验证实验表明基于此探针的生物传感器选择性好。基于纳米技术的DNA探针具有很好生物相容性,并且灵敏度和选择性非常好,在未来的分析研究中将会有很好的应用。二、自动的指数倍放大DNA的DNA分子机器及其在三磷酸腺苷电化学分析中的应用构建了一种新的可自动运行的信号放大型DNA分子机器,可完成DNA的指数倍放大。它是利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow大片段的聚合作用驱动反应进行,实现信号转换,并输出指数倍放大的DNA。再用夹心法捕获这些DNA,并与DNA桥接金纳米粒子负载CuS纳米粒子的多极放大探针杂交,将输出的DNA转换为电化学信号,用灵敏的DPASV进行检测。该DNA分子机器操作1 h,可使检测DNA的灵敏度增加两个数量级,在优化的实验条件下,检测靶DNA的线性范围是1.0×10–16mol/L1.0×10–14mol/L,检测限可达2.8×10-17mol/L（3σ）,放大效率更高。同时,以磁珠为DNA的固相载体,便于循环反应的控制,同时实现了信号DNA从DNA分子机器本体的输出。此外,将适体识别元件与DNA分子机器相结合,以三磷酸腺苷（ATP）为模板分子,考察了这种新型DNA分子机器的性能,并实现了癌细胞中ATP的检测。在优化的实验条件下检测ATP的线性范围是2.0×10–8mol/L2.0×10–6mol/L,检测限为4.7×10-9mol/L（3σ）。总之,这种新型DNA机器结构简单,可自动化运行且信号放大效率高。通过改变DNA序列,更可应用到多种适体小分子的检测中,具有潜在的应用价值。三、DNA分子机器双循环放大检测DNA构建了一种通过双循环放大检测目标DNA的DNA分子机器。双循环工作模式包含链断裂自循环模式和链断裂交叉循环模式,这两种循环模式均通过两种不同的内切酶协同来完成。采用生物条码的CdS纳米粒子–DNA探针组装到DNA分子机器系统来寻踪目标DNA。当目标DNA进入到系统中,DNA机器就会被触发,然后自主的进行双循环工作模式来产生信号,整个过程可以根据需要来很好的控制。信号的检出是通过在酸性溶液中溶解CdS纳米粒子–DNA探针,然后使用DPASV方法对获得的Cd2+进行检测。Cd2+在–0.63V,同时获得了相应目标DNA浓度的对应电信号,从而达到检测目的。在优化的实验条件下,检测靶DNA的线性范围是1.0×10–16mol/L8.0×10–14mol/L,检测限为4.1×10-17 mol/L（3σ）。因此,该DNA分子机器能够显著放大DNA。尽管这种DNA分子机器有复杂的结构,但是它能通过简单的操作来连续的执行类似机器的行为,且整个检测过程在室温下操作30 min就可以完成,方法灵敏度高,选择性好,且操作简单。生物医学诊断以及环境监测方面有潜在的应用价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 DNA 生物传感器
• 1.1.1 DNA 的化学结构
• 1.1.2 DNA 生物传感器的设计原理
• 1.1.3 DNA 生物传感器的分类
• 1.2 纳米粒子在 DNA 生物传感器中的应用
• 1.2.1 纳米粒子简介
• 1.2.2 纳米粒子的特点
• 1.2.3 纳米金在DNA 生物传感器中的应用
• 1.2.4 纳米硫化铜和硫化镉粒子在DNA 生物传感器中的应用
• 1.3 核酸适体在DNA 生物传感器中的应用
• 1.3.1 适体简介
• 1.3.2 适体的特点
• 1.4 DNA 分子机器的研究
• 1.4.1 DNA 分子机器简介
• 1.4.2 DNA 分子机器的分类
• 1.4.3 DNA 分子机器的应用意义
• 1.5 电化学检测
• 1.5.1 伏安法简介
• 1.5.2 阳极溶出伏安法
• 1.5.3 阴极溶出伏安法
• 1.5.4 差分脉冲溶出伏安法
• 1.6 研究现状
• 1.6.1 DNA 纳米材料研究现状
• 1.6.2 DNA 分子机器研究现状
• 1.7 立题依据和研究内容
• 参考文献
• 第二章 高灵敏的基于一对一识别靶 DNA 的三胶体金/硫化铜纳米粒子探针的电化学DNA 传感器
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 电化学DNA 生物传感器的构造原理
• 2.3.2 扫描电子显微镜表征
• 2.3.3 一对一识别靶DNA 的三胶体金DNA 探针的紫外表征
• 2.3.4 基于一对一识别靶DNA 的三胶体金DNA 探针的电化学传感器的灵敏度
• 2.3.5 电化学传感器的选择性
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第三章 自动的指数倍放大 DNA 的 DNA 分子机器及其在三磷酸腺苷电化学分析中的应用
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 DNA 分子机器实验原理
• 3.3.2 用DNA 分子机器放大检测ATP 实验原理
• 3.3.3 聚合反应时间优化
• 3.3.4 DNA 分子机器的灵敏度
• 3.3.5 DNA 分子机器用于ATP 检测的灵敏度
• 3.3.6 DNA 分子机器用于ATP 检测的选择性
• 3.3.7 高效液相色谱检测ATP
• 3.3.8 DNA 分子机器的实用性
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第四章 结论
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文