低氧对神经干细胞增殖和分化的影响及HIF-1的作用机制

论文摘要

神经干细胞（neural stem cell，NSC）是具有高度自我更新能力和多项分化潜能的神经前体细胞。它能最终分化形成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，因此对治疗神经退行性疾病和损伤有着广阔的应用前景，目前已成为神经系统领域的研究热点。而氧是生命存在的必要条件，也是细胞生理功能的一种重要调节因子，氧浓度的变化可影响细胞的功能状态。目前关于低氧作用的研究多集中在低氧对细胞的损伤和有关的适应机制方面，而关于低氧在细胞增殖和分化中的作用研究较少，特别是关于低氧对NSCs增殖和分化的影响目前还不太清楚。低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）是细胞低氧反应的核心调控因子，诸多研究表明它在肿瘤细胞增殖中起着重要的调控作用，但关于它是否参与低氧对NSCs增殖和分化的影响国内外未见报道。因此本研究利用各种细胞分子生物学手段，比较了不同氧浓度对NSCs增殖和分化的影响，观察了低氧后NSCs内HIF-1α的表达变化，并探讨HIF-1α在低氧引起的NSCs增殖和分化中的作用。 一、神经干细胞分离、培养和鉴定以及低氧浓度测定 Wistar孕大鼠（E13.5d）戊巴比妥钠麻醉后，无菌条件下取出胎鼠，分离胎鼠中脑NSCs。传3代后，制成单细胞悬液，在涂有多聚赖氨酸（0.1mg／mL）的confocal皿中贴壁半小时，4％多聚甲醛固定后，用免疫组化进行Nestin鉴定，鉴定结果表明几乎所有细胞均为Nestin染色阳性，说明我们培养的NSCs较纯，可用于下面的实验。 我们把通过以上方法得到的NSCs分别置于不同环境氧浓度中（20％ O2，10％ O2，3％ O2，0％ O2），培养3d后，分别用血气分析仪和自动生化分析仪测定细胞培养上清中的氧分压和乳酸浓度。氧分压依次为153±7、105±5、80±10和65±15mmHg；乳酸浓度依次为0.875±0.251、1.425±0.112、1.825±0.220和2.096±0.233mmol／L。由以上结果可以看出，随着环境氧浓度的下降，细胞培养上清中的氧分压随之下降，而乳酸浓度随之增高，在环境氧浓度为0％ O2时，细胞培养上清的乳酸浓度达2.096mmol／L。乳酸浓度过高不利于细胞生长，因此在以下的实验中，我们采用10％和3％氧浓度来观察低氧对NSCs增殖和分化的影响。

论文目录

• 目录
• 英文缩写词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 神经干细胞分离、培养和鉴定以及低氧浓度测定
• 一、实验材料
• 1.主要仪器
• 2.主要试剂
• 3.实验取材
• 二、实验方法
• 1.神经干细胞分离培养
• 2.免疫组化鉴定神经干细胞
• 3.实验分组
• 2'>4.血气分析仪测定细胞培养上清中的PO₂
• 5.生化分析仪测定细胞培养上清中的乳酸浓度
• 6.统计分析
• 三、实验结果
• 1.神经干细胞培养
• 2.神经干细胞鉴定结果
• 2'>3.细胞培养上清中的PO₂
• 4.细胞培养上清中的乳酸浓度
• 四、讨论
• 结论
• 第二部分 低氧对神经干细胞增殖的影响及HIF-1的作用
• 一、实验材料
• 1.主要仪器
• 2.主要试剂
• 3.实验取材
• 二、实验方法
• 1.神经干细胞分离培养
• 2.实验分组及实验流程
• 3.神经球记数法
• 4.流式细胞术测定增殖指数
• 5.免疫组化检测Brdu阳性细胞数
• 6.细胞记数法
• 7.RT-PCR检测HIF-1α mRNA的表达
• 8.Western blot检测HIF-1α蛋白的表达
• 9.HIF-1α腺病毒载体构建
• 10.腺病毒感染神经干细胞
• 11.HIF-1α的RNAi载体构建
• 12.RNAi载体转染神经干细胞
• 13.统计分析
• 三、实验结果
• 1.低氧对神经干细胞增殖的影响
• ① 神经球记数结果
• ② 增殖指数测定结果
• ③ Brdu阳性细胞数
• 2.10％低氧过程中神经干细胞内HIF-1α的表达变化
• ① HIF-1α mRNA的表达变化
• ② HIF-1α蛋白的表达变化
• 3.过表达HIF-1α对神经干细胞增殖的影响
• ① 腺病毒载体制备
• ② 神经干细胞腺病毒感染效果评价
• ③ 腺病毒感染后HIF-1α蛋白表达检测结果
• ④ 神经干细胞过表达HIF-1α后增殖指数测定结果
• ⑤ 神经干细胞过表达HIF-1α后细胞记数结果
• 4.抑制HIF-1α表达对神经干细胞增殖的影响
• ① RNAi载体制备
• ② RNAi效果评价
• ③ 转染RNAi质粒后神经干细胞HIF-1α蛋白表达检测结果
• ④ 转染RNAi质粒后增殖指数测定结果
• 四、讨论
• 结论
• 第三部分 低氧对神经干细胞分化的影响及HIF-1的作用
• 一、实验材料
• 1.主要仪器
• 2.主要试剂
• 3.实验取材
• 二、实验方法
• 1.神经干细胞分离培养
• 2.实验分组及实验流程
• 3.免疫组化检测神经元及胶质细胞标志性蛋白
• 4.流式细胞术测定FITC标记的TH阳性细胞
• 5.高效液相色谱检测培养上清DA含量
• 6.RT-PCR检测HIF-1α mRNA的表达
• 7.Western blot检测HIF-1α蛋白的表达
• 8.流式细胞术测定GFP和PE双标记TH阳性细胞
• 9.统计分析
• 三、实验结果
• 1.低氧对神经干细胞分化方向的影响
• ① 向神经元和胶质细胞方向的分化结果
• ② 向TH阳性神经元方向的分化结果
• ③ 培养上清DA含量检测结果
• 2.3％低氧诱导过程中神经前体细胞内HIF-1α的表达变化
• ① HIF-1α mRNA的表达变化
• ② HIF-1α蛋白的表达变化
• 3.过表达HIF-1α对神经干细胞分化方向的影响
• ① 分化神经干细胞腺病毒感染效果评价
• ② 腺病毒感染后HIF-1α蛋白表达检测结果
• ③ 过表达HIF-1α后TH阳性细胞比例
• ④ 过表达HIF-1α后培养上清DA含量测定结果
• 四、讨论
• 结论
• 总结
• 参考文献
• 文献综述
• 文章（一）
• 文章（二）
• 博士期间发表和待发表的文章、学术会议及基金申请
• 致谢