论文摘要
目的:研究香加皮杠柳苷对乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡的影响,分析杠柳苷对MDA-MB-231细胞内Stat3转录活性和Stat3下游抗凋亡基因表达的调节作用,探讨杠柳苷的抗肿瘤作用机制,为其作为抗肿瘤新药开发提供参考依据。方法:1采用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）检测不同浓度杠柳苷（0.078、0.156、0.313、0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/ml）,处理不同时间（24h、48h和72h）对MDA-MB-231细胞增殖反应的抑制作用;2瑞姬染色观察杠柳苷作用后细胞形态学变化;琼脂糖凝胶电泳分析杠柳苷（ 2.5μg/ml ）处理48小时后MDA-MB-231细胞的DNA梯度降解（DNA Ladder）变化,分析杠柳苷对细胞凋亡的影响;3采用流式细胞技术（flow cytometry,FCM）检测杠柳苷（2.5μg/ml）作用不同时间（0h、12h、24h和48h）,MDA-MB-231细胞凋亡情况;4采用免疫印迹（western blot）方法检测不同浓度杠柳苷（0.625μg/ml、2.5μg/ml）作用24小时后,MDA-MB-231细胞中磷酸化Stat3（p-Stat3）、细胞核及细胞质中Stat3的表达变化;5采用电泳迁移率改变（EMSA）方法分析杠柳苷（0.625μg/ml、2.5μg/ml）作用24小时前后MDA-MB-231细胞核蛋白与Stat3特异性DNA探针结合能力变化;6采用逆转录-聚合酶链反应（revers transcription PCR,RT-PCR）半定量检测杠柳苷（2.5μg/ml）作用不同时间（0h、6h、12h和24h）,MDA-MB-231细胞抗凋亡基因bcl-2、survivin、mcl-1的表达变化;7应用激光共聚焦显微镜（laser scanning microscope, LSM）观察杠柳苷（2.5μg/ml）作用不同时间（0min、5min、15min）后,MDA-MB-231细胞内Ca2+浓度和Bax、Stat3蛋白的表达变化。结果:1杠柳苷在0.07820μg/ml浓度范围内能明显抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231体外增殖反应,随着浓度和作用时间增加,对细胞增殖的抑制率升高,其中20μg/ml杠柳苷作用72小时的抑制率最高（为65.32%）。不同浓度杠柳苷对细胞的抑制率均有显著性差异（p<0.05）;2瑞姬染色观察杠柳苷作用后MDA-MB-231细胞形态呈现凋亡前期改变;经2.5μg/ml杠柳苷作用48h后,MDA-MB-231细胞DNA出现明显的梯度图象（DNA Ladder）,提示细胞发生凋亡;流式细胞技术检测结果显示,随着杠柳苷作用时间延长,细胞的凋亡率升高,以2.5μg/ml杠柳苷作用48 h凋亡率最高,为28.66%,各组之间比较有显著性差异（p<0.05）;3 Western blot分析结果显示,经0.625μg/ml、2.5μg/ml杠柳苷处理24小时后,MDA-MB-231细胞中磷酸化Stat3、细胞核及细胞质内Stat3表达量与未处理组细胞比较均有所下降（p<0.05）,且2.5μg/ml组比0.625μg/ml组下降明显,具有显著性差异（p<0.05）;4 EMSA分析结果显示,经0.625μg/ml、2.5μg/ml杠柳苷作用24小时后,MDA-MB-231细胞核蛋白与Stat3特异性DNA探针结合能力下降;5半定量RT-PCR检测结果显示,随着杠柳苷处理时间的延长,不同处理时间组（6h、12h和24h）抗凋亡基因bcl-2、mcl-1、survivin mRNA表达水平逐渐降低,与未处理组（0h）比较有显著性差异（p<0.05）;6 LSM荧光图像分析结果显示,杠柳苷（2.5μg/ml）作用5分钟后,MDA-MB-231细胞内Ca2+浓度和Bax蛋白表达明显增加,作用15分钟后进一步增加,与作用前比较有显著性差异（p<0.05）,而杠柳苷作用后MDA-MB-231细胞内Stat3蛋白表达降低,15分钟组Stat3蛋白仅在细胞边缘少量表达（p<0.05）。结论:1杠柳苷在一定浓度范围内,能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖,具有明显的量效和时效关系;2杠柳苷可诱导MDA-MB-231细胞凋亡;3杠柳苷可抑制Stat3信号转导通路。通过降低MDA-MB-231细胞中酪氨酸磷酸化Stat3（p-tyr705-Stat3）水平和细胞质、细胞核中Stat3表达,干扰Stat3转录活性;4杠柳苷抑制MDA-MB-231细胞抗凋亡基因bcl-2、survivin、mcl-1的mRNA表达,该过程可能与杠柳苷阻碍Stat3信号通路有关;5杠柳苷作用后,MDA-MB-231细胞内Ca2+浓度、Bax蛋白水平明显升高,提示Ca2+和Bax共同参与了杠柳苷诱导细胞凋亡过程;6抑制Stat3活性可能是杠柳苷抑制MDA-MB-231细胞增殖,诱导细胞凋亡的机制之一。