论文摘要
肝纤维化（hepatic fibrosis）是各种致病因子引起慢性肝病,进而发展为肝硬化的一个动态过程,其主要病理改变是细胞外间质（extracellular matrix, ECM）的过度合成与异常沉积。肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）是参与该过程的最重要细胞,它的激活导致自身增殖和胶原合成增加,可明显促进肝纤维化的发生发展,而肝纤维化恢复期HSCs凋亡明显增多。所以,HSCs在肝纤维化的形成和逆转过程中发挥关键作用,被认为是各种肝脏损伤引起肝纤维化的中心环节。研究表明,HSCs可以表达神经标志物,并接受交感神经和副交感神经纤维的神经支配。HSCs可以合成和释放去甲肾上腺素（norepinephrine, NE）、多巴胺（dopamine, DA）、5-羟色胺（hydroxytryptamine, 5-HT）等神经递质,HSCs还表达α1B、α1D、β1、β2等肾上腺素受体。提示HSCs可能来源于神经嵴,并作为肝脏的神经内分泌细胞接受交感神经系统传出信号的神经支配,发生表型改变,调节肝脏功能。交感神经系统（sympathetic nervous system, SNS）分布广泛,几乎参与了体内所有系统的功能调节。已有研究结果证实,肝硬化患者的交感神经系统活性升高、循环儿茶酚胺含量增加。体外实验研究也证实,交感神经递质NE可以明显促进HSCs的增殖。由此可知,交感神经系统可以通过对HSCs生物学行为的调节参与肝纤维化的进展。但是,关于肝纤维化形成过程中,交感神经递质与特定肾上腺素受体亚型结合后对HSCs生物学行为的影响及其机制,目前国内外均未见报告。因此,我们应用胆总管结扎法建立胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型,检测肾上腺素受体各亚型的表达与肝纤维化发展的关系;进一步在细胞水平分别给予去甲肾上腺素α受体及β受体的阻滞剂,检测其对HSCs增殖、凋亡以及胶原代谢的作用,并探讨交感神经递质调控HSCs生物学行为的信号转导机制,旨在阐明交感神经系统在肝纤维化发生发展中的作用及其机制,从而寻求有效的预防和治疗肝纤维化的新思路、新策略。实验内容主要包括以下四部分:第一部分肝纤维化过程中去甲肾上腺素各受体亚型表达的动态变化目的:研究肝纤维化过程中去甲肾上腺素各受体亚型表达的动态变化。方法:胆总管结扎法建立胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型,HE、Masson染色观察肝脏病理形态学变化,免疫组织化学法检测HSCs活化指标α-SMA的表达,Western blot和Real-time Q-PCR检测α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白和mRNA的表达。结果:①术后大鼠一般情况观察:大鼠胆总管结扎后1 h～2 h恢复活动,48 h左右尿液变黄,3～4天后皮肤毛发开始转黄,精神逐渐变差,进食量少于对照组,体重增加不明显或稍有下降。5～6天一般状况渐差,嗜睡,反应迟缓,活动减少,黄疸明显,鼠粪呈灰白色。20天后进食量明显减少,体重与对照组相比明显降低,并且部分大鼠逐渐出现腹部隆起。②肝组织病理组织学变化:模型大鼠肝脏肉眼观呈褐绿色或棕色,表面略呈细颗粒状,质地变硬。HE及Masson三色染色显示,假手术对照组肝小叶结构完整,肝板排列整齐,肝细胞无肿胀,无胆管增生,无淤胆及淋巴细胞浸润,核仁清晰,少量结缔组织局限于门管区。造模1 wk后,模型组肝细胞出现散在变性、坏死及炎细胞浸润,部分区域出现小片状坏死,门管区小胆管样上皮细胞增生。造模2 wk后,模型组肝板正常排列消失,肝小叶结构紊乱,门管区小胆管广泛增生,并向小叶内延伸、肝小叶呈花环状;新生小胆管周围纤维组织增生,门管区面积扩大,肝小叶内亦有纤维组织增生。造模3 wk～4 wk后,模型组肝脏广泛纤维结缔组织增生,增生的纤维间隔互相连接、包绕、分割,改建原来的肝小叶甚至形成假小叶。Masson三色染色胶原面积密度测定结果显示:模型组1 wk、2 wk、3 wk、4 wk胶原面积密度（10.11%±1.14%,21.14%±1.22%,28.87%±2.05%,37.44%±3.17%）均显著高于假手术对照组（3.22%±0.77%）,P<0.01。③α-SMA免疫组织化学染色显示:正常大鼠肝组织中仅在血管壁平滑肌细胞有弱阳性表达;随着肝纤维化的发展,大鼠肝组织中α-SMA阳性细胞明显增多,主要分布于汇管区、纤维间隔、肝窦周围及增生的胆管周围细胞,造模1 wk～4 wk大鼠肝组织α-SMA的阳性面积（10.58%±1.75%,24.14%±2.02%,29.74%±2.59%,34.28%±2.01%）均显著高于假手术组（4.12%±1.51%）,P<0.01。即肝纤维化程度越重α-SMA染色阳性细胞数量亦越多。④Western blot检测结果显示,分别在大约57 kD、50 kD、47 kD位置出现α-AR、β1-AR、β2-AR特异性条带,在43 kD位置可见β-actin条带。假手术组有少量肾上腺素受体蛋白表达,随着肝纤维化进展其表达逐渐增加,造模1 wk～4 wk大鼠肝组织α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白表达量明显升高（1.54±0.08, 1.87±0.15, 2.72±0.09, 2.84±0.18 vs 0.85±0.12, P<0.05;1.57±0.18, 1.92±0.11, 2.51±0.17, 2.89±0.19 vs 0.98±0.15, P<0.05;1.84±0.20, 1.97±0.09, 2.85±0.14, 3.87±0.18 vs 1.24±0.18, P<0.05）。⑤Real-time Q-PCR共扩增检测α-AR、β1-AR、β2-AR和内参照GAPDH基因表达,根据:△c（t）实验组=c（t）目的基因-c（t）GAPDH,△c（t）对照组=c（t）目的基因-c（t）GAPDH,△△c（t）=△c（t）实验组-△c（t）对照组,目的基因的相对表达量folds=2-△△c（t）计算α-AR、β1-AR、β2-AR mRNA相对表达量。结果证实,随着肝纤维化的发展,α-AR、β1-AR、β2-AR mRNA表达逐渐上调,造模4 wk表达最多（1.54±0.08, 2.98±0.09, 3.23±0.11, 3.94±0.13 vs 1.00±0.07, P<0.01; 1.47±0.10, 2.13±0.09, 2.54±0.12, 2.81±0.10 vs 1.00±0.10, P<0.01; 1.24±0.07, 2.78±0.10, 3.54±0.14, 4.24±0.15 vs 1.00±0.08, P<0.01）。⑥α-SMA与α-AR、β1-AR、β2-AR的多元相关分析显示,α-SMA与α-AR、β1-AR及β2-AR呈正相关,r值分别为0.564、0.753和0.606。结论:胆总管结扎法成功建立胆汁淤积性大鼠肝纤维化模型,肝纤维化形成过程中HSCs大量活化、增殖,α-SMA表达增加。随着肝纤维化进展,α-AR、β1-AR、β2-AR蛋白及mRNA含量明显增加,与α-SMA呈明显的正相关。第二部分交感神经递质NE对HSCs生物学行为的影响目的:探讨交感神经递质去甲肾上腺素对体外培养的肝星状细胞增殖、凋亡及胶原代谢的影响。方法:体外培养HSCs,用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测NE对HSCs增殖的影响;原位杂交凋亡检测（TUNEL）法观察NE对HSCs凋亡的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞凋亡调控基因bcl-2和bax的蛋白表达情况;倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;用Real-time Q-PCR检测Ⅰ型胶原mRNA的表达;并用Western blot和Real-time Q-PCR检测MMP-13和TIMP-1蛋白和mRNA的表达。结果:①MTT法显示,不同浓度NE作用于HSCs,实验组A值均高于对照组;NE浓度为10μmol·L-1时促增殖作用达峰值（0.262±0.085 vs 0.084±0.053, P<0.05）;不同浓度NE作用于HSCs,随作用时间延长NE的促增殖作用增强;②10μmol·L-1浓度NE作用于HSCs 24 h,TUNEL和流式细胞术检测HSCs凋亡率均显著低于对照组（6.60%±3.05% vs 12.60%±4.76%, P<0.01;2.29%±0.22% vs 3.06%±0.57%, P<0.05）;③并伴有凋亡调控基因的改变:NE作用HSCs 24 h后,bax表达下降,对照组和NE组分别为9.60%±1.76%和6.60%±2.75%,P<0.05;而bcl-2表达增加,对照组和NE组分别为7.06%±0.54%和14.29%±0.41%, P<0.05;④NE对细胞形态没有明显影响:肝星状细胞系接种于培养瓶中,贴壁生长,大多数细胞呈多角形,约24 h后,细胞进入对数生长期,即贴壁生长成致密的单细胞层。NE作用后72 h,细胞增殖显著,显微镜下未见明显细胞形态改变;⑤Real-time Q-PCR检测NE对HSCs表达Ⅰ型胶原的影响:加入不同浓度NE （1、10、100μmol·L-1）,Ⅰ型胶原mRNA相对表达量显著高于对照组（1.47±0.09,1.91±0.11,2.46±0.15,P<0.05）;⑥Western blot检测NE对HSCs表达MMP-13和TIMP-1的影响:结果显示,在大约60 kD位置出现MMP-13特异性条带,在大约28 kD位置出现TIMP-1特异性条带,在43 kD位置可见β-actin条带。加入不同浓度NE（1、10、100μmol·L-1）,MMP-13蛋白相对表达量（0.75±0.24,0.57±0.11,0.37±0.08）均显著低于对照组（0.98±0.21）,P<0.05;TIMP-1蛋白相对表达量（0.57±0.09,1.01±0.14,1.15±0.17）均显著高于对照组（0.55±0.05）,P<0.01。MMP-13/TIMP-1比值明显降低（1.32±0.05,0.56±0.10,0.32±0.09 vs 1.78±0.10, P<0.01）;⑦Real-time Q-PCR检测NE对HSCs表达MMP-13和TIMP-1的影响:以对照组MMP-13、TIMP-1 mRNA表达量为标准,各实验组MMP-13、TIMP-1的表达量相对于对照组的变化用以下公式计算:△c（t）实验组=c（t）目的基因-c（t）GAPDH,△c（t）对照组=c（t）目的基因-c（t）GAPDH,△△c（t） =△c（t）实验组-△c（t）对照组,目的基因的相对表达量folds =2-△△c（t）计算MMP-13、TIMP-1 mRNA相对表达量。结果证实,加入不同浓度NE（1、10、100μmol·L-1）,MMP-13 mRNA相对表达量（0.81±0.13,0.59±0.07,0.48±0.08）均显著低于对照组,P<0.05;TIMP-1 mRNA相对表达量（1.47±0.12,1.91±0.14,2.06±0.11）均显著高于对照组,P<0.05。以同一个对照得出MMP-13/TIMP-1基因表达比值,结果显示比值显著降低（0.55±0.09,0.31±0.10,0.23±0.07,P<0.05）。结论:交感神经递质NE对体外活化的HSCs具有促进增殖和抑制凋亡的作用,并引起凋亡调控基因bax表达下降,而bcl-2表达增加。NE还可以使HSCs MMP-13表达降低,TIMP-1表达升高,进而降低MMP-13/TIMP-1比值,从而减少其对肝脏胶原降解的作用,使HSCsⅠ型胶原表达量增加,从而加速肝纤维化的进展。第三部分去甲肾上腺素各受体亚型对HSCs生物学行为的调控作用目的:探讨交感神经递质去甲肾上腺素各受体亚型对肝星状细胞生物学行为的影响。方法:体外培养HSCs,Western blot检测HSCs肾上腺素受体（α-AR、β1-AR及β2-AR）蛋白的表达;免疫细胞化学法检测肾上腺素受体亚型在HSCs的分布与定位;Real-time Q-PCR检测HSCs肾上腺素受体（α-AR、β1-AR及β2-AR）mRNA的表达。细胞干预分为以下6组:①空白对照组,为单纯HSCs培养;②交感兴奋组（NE）;③α-AR阻滞组（酚妥拉明）;④β1-AR阻滞组（CGP20712A）;⑤β2-AR阻滞组（ICI118551）;⑥交感抑制组（酚妥拉明+普萘洛尔）。MTT法测定细胞增殖;TUNEL法观察HSCs凋亡状况;流式细胞术检测细胞凋亡率及凋亡调控基因bax和bcl-2的变化;Real-time Q-PCR检测Ⅰ型胶原mRNA的表达;并用Western blot和Real-time Q-PCR检测MMP-13和TIMP-1蛋白和mRNA的表达。结果:①Western blot检测HSCsα-AR、β1-AR及β2-AR蛋白的表达,分别在大约57 kD、50 kD、47 kD位置出现α-AR、β1-AR、β2-AR特异性条带,在43 kD位置可见β-actin条带;免疫细胞化学法检测肾上腺素受体亚型定位于的细胞膜和细胞浆;Real-time Q-PCR检测HSCs表达α-AR、β1-AR及β2-AR mRNA。②MTT法显示,10μmol·L-1的NE作用于HSCs,实验组A值明显高于对照组,加入α-AR、β1-AR、β2-AR阻滞剂后,实验组A值均显著下降,HSCs增殖受抑制,α-AR和β-AR阻滞剂合用增殖受抑制更明显。③TUNEL法显示加入受体阻滞剂后HSCs凋亡率升高,其中α-AR和β2-AR阻滞剂作用最显著,凋亡百分比分别为17.40%±4.51%和21.40%±3.51%,P<0.01;加入β1-AR阻滞剂CGP20712A凋亡率也升高,凋亡百分比为13.60%±3.29%,P>0.05。④同时,流式细胞术显示加入受体阻滞剂后HSCs凋亡率升高,其中α-AR和β2-AR阻滞剂作用最显著,凋亡率分别为5.04%±1.44%和5.99%±2.14%,P<0.05;加入β1-AR阻滞剂CGP20712A凋亡率也升高,与对照组相比P>0.05。⑤流式细胞术检测凋亡调控基因的变化:加入α和β2受体阻滞剂后凋亡调控基因表达改变,bax表达上调（11.40±2.51, 10.40±1.41 vs 9.60±1.76, P<0.05）,而bcl-2表达下降（5.04±1.44, 4.99±1.41 vs 7.06±0.54, P<0.05）;加入β1-AR阻滞剂CGP20712A凋亡基因变化不明显,与对照组相比差异无统计学意义,P>0.05。⑥Real-time Q-PCR检测NE受体阻滞剂对HSCs表达Ⅰ型胶原的影响:结果显示,加入α-AR、β1-AR、β2-AR阻滞剂后HSCsⅠ型胶原表达降低,mRNA相对表达量分别为0.40±0.11、0.74±0.10和0.31±0.09,P<0.05;α和β受体阻滞剂合用效果更明显。⑦Western blot检测NE受体阻滞剂对HSCs表达MMP-13、TIMP-1蛋白的变化情况。结果显示,在大约60 kD位置出现MMP-13特异性条带,在大约28 kD位置出现TIMP-1特异性条带,在43 kD位置可见β-actin条带。加入α-AR、β1-AR、β2-AR阻滞剂后HSCs表达MMP-13蛋白明显升高（0.99±0.08, 1.26±0.13, 1.27±0.07 vs 0.98±0.21, P<0.05）;TIMP-1蛋白相对表达量显著低于对照组（0.37±0.02, 0.54±0.21, 0.44±0.09 vs 0.55±0.05）;MMP-13/TIMP-1的比值升高（2.68±0.07, 2.33±0.08, 2.89±0.12 vs 1.78±0.10, P<0.01）。α和β受体阻滞剂合用效果更明显。⑧Real-time Q-PCR检测NE受体阻滞剂对HSCs表达MMP-13和TIMP-1 mRNA的影响:以对照组MMP-13、TIMP-1 mRNA表达量为标准,各实验组MMP-13、TIMP-1的表达量相对于对照组的变化用以下公式计算:△c（t）实验组=c（t）目的基因-c（t）GAPDH,△c（t）对照组=c（t）目的基因-c（t）GAPDH,△△c（t） =△c（t）实验组-△c（t）对照组,目的基因的相对表达量folds=2-△△c（t）计算MMP-13、TIMP-1 mRNA相对表达量。加入α-AR、β1-AR、β2-AR阻滞剂后HSCs MMP-13表达升高,mRNA相对表达量分别为1.98±0.18、1.08±0.15和1.83±0.14,P<0.05;TIMP-1 mRNA相对表达量显著低于对照组（0.54±0.08, 0.89±0.10, 0.49±0.07, P<0.05） ,MMP-13/TIMP-1比值升高（3.67±0.08, 1.21±0.11, 3.73±0.12, P<0.01）。α和β受体阻滞剂合用效果更明显。结论:HSCs可以表达α-AR、β1-AR和β2-AR肾上腺素受体蛋白和mRNA,主要分布于HSCs的细胞膜和细胞浆。α-AR、β1-AR和β2-AR特异性阻滞剂均可以抑制HSCs增殖、诱导其凋亡。并可以拮抗NE引起的凋亡基因的变化,使bax表达下降,bcl-2表达升高。其中,α-AR阻滞剂酚妥拉明和β2-AR阻滞剂ICI118551效果最明显。NE受体阻滞剂促进HSCs MMP-13表达,显著降低TIMP-1表达,MMP-13/TIMP-1比值回升;Ⅰ型胶原mRNA表达亦明显降低。第四部分NE调控HSCs生物学行为的信号转导机制目的:探讨交感神经递质去甲肾上腺素对肝星状细胞生物学行为影响的信号传导机制。方法:体外培养HSCs,加入PI-3K信号通路抑制剂LY294002,用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测NE对HSCs增殖的影响;TUNEL法和流式细胞术检测凋亡情况;Western blot检测PI-3K蛋白表达的变化情况。结果:①NE促进HSCs增殖,加入PI-3K信号通路抑制剂LY294002后细胞增殖受抑制;②NE作用于HSCs 24 h,TUNEL法和流式细胞术均证实HSCs凋亡率显著低于对照组,加入PI-3K信号通路抑制剂LY294002后HSCs凋亡率升高（14.40%±4.51% vs 6.60%±3.05% by TUNEL, P<0.05; 5.04%±1.44% vs 2.29%±0.22% by FCM, P<0.05）;③加入PI-3K信号通路抑制剂LY294002后,Western blot证实PI-3K蛋白表达减少。结论:交感神经递质NE可以促进HSCs增殖,抑制HSCs凋亡,与PI-3K信号通路相关。
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