甘薯ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆与遗传转化

论文摘要

甘薯是全球第六大作物,薯抗灾力强,耐旱,耐瘠薄,丘陵山区也能种植,在作物较难生长的地方,甘薯也能获得较好的产量。甘薯因块根富含淀粉既能用做食物又能作为工业原料而广泛的被种植。这些特性吸引了越来越多研究者深入到了甘薯这个领域。淀粉是植物通过光合作用产生的一种多糖高分子化合物,淀粉生物合成过程中存在四种关键酶,即：ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase, AGpase）、淀粉合成酶（starch synthase,）,分支酶（branching enzyme,）及去分支酶（de-branching enzyme,）。在AGPase的作用下,葡萄糖-1-磷酸（Glu-1-P）与ATP作用生成ADP-葡萄糖（ADP-GIu）,随后ADP-Glu在SS的作用下进行链的延伸。当链达到一定长度后，在SBE作用下于线性链之间引入a-1,6-糖苷键形成分枝,并进一步在SS催化下延长分枝,DBE对分枝进行修饰,最后合成具有一定结构特性的淀粉结晶体。AGPase催化淀粉合成的第一步,是淀粉合成过程中的限速酶,其活性的改变将直接影响着淀粉的合成速率,直接决定贮藏组织中淀粉的水平,从而最终决定了植物的产量。AGP为四聚体,,ibAGPase有α、β两种亚基,其中小亚基α的两个编码基因为ibAGPal和ibAGPa2。两个α亚基在物种中非常保守,是酶的催化中心；编码IbAGPase大亚基β亚基的基因,目前有ibAGPb1A, ibAGPb1B, ibAGPb2, ibAGPb3共计四个。β亚基是酶活性调节中心,可能与识别、Glu结合、调控有关,物种间的保守性比小亚基α的低。AGP合成酶两种亚基的基本氨基酸序列不同,大亚基主要起调控作用,而小亚基与底物结合,起催化作用。本研究以总RNA逆转录的cDNA为模板,用特异引物PCR扩增出了甘薯AGPase基因两小亚基的序列,分析表明a1亚基与a2亚基氨基酸同源性达90%以上。AGPal蛋白和AGPa2蛋白预测相对分子量分别为57.109KD和57.113KD,等电点为7.23和7.89。利用表达载体PCAMBIA1301,在其多克隆位点插入了含35S启动子和NOS的表达框,分别用HindⅢ和XbaⅠ双酶切PCAMBIA1301-35s, HindⅢ/EcoRI双酶切pCambia1301-35S-Nos,检测35S和NOS的插入情况,再将2个目的基因分别插入其中,构建了PCAMBIA1301-35s-AGPase al-NOS PCAMBIA1301-35s-AGPase a2-NOS两个表达载体,分别用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切1301-A1载体,XbaⅠ和sacⅠ双酶切1301-A2载体进行检测。浸染的5个甘薯品种经过预培养,浸染,共培养后,在筛选培养基上1个多月左右,在一些茎段的切口处肉眼可以看到长出了芽;生长比较缓慢,到2个月多月的时候能长到5CM左右,将其切下转入生根培养基。有些侧芽在生根培养基上逐渐的被抗生素筛死。被侵染的叶柄、叶片少数有少量的愈伤出现,但不分化成植株。叶柄、叶片和大部分未分化出侧芽的茎段在4个月左右时全部死亡。此次转化的茎段大概有300个左右,最后成活的侧芽有25个,检测了其中的14个抗性芽,获得了5株阳性植株,相对其他转化方法,这种方法转化的效率较高,但可能存在一定的嵌合体,有待进一步的证实。以茎段为转化受体,在MS+KT 2.0mg/L+NAA 0.5 mg/L+Hyg 50mg/L+Cef 200 mg/L的筛选培养基上获得了转基因植株的再生。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 甘薯
• 1.1.1 甘薯的生物学特性
• 1.1.2 甘薯的经济价值及应用
• 1.2 生物技术在甘薯育种中的应用
• 1.2.1 甘薯遗传转化系统
• 1.2.2 甘薯转基因育种的进展
• 1.3 淀粉合成酶
• 1.3.1 ADP葡萄糖焦磷酸化酶及其基因的研究进展
• 1.3.2 淀粉合成酶（SS）
• 1.3.3 淀粉分枝酶（SBE）
• 1.3.4 淀粉脱分枝酶（DBE）
• 1.3.5 植物淀粉合成的调控策略
• 第二章 绪论
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 研究范围和内容
• 第三章 材料与方法
• 3.1 供试材料、试剂和仪器
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 试剂及试剂盒
• 3.1.3 菌株
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.1.5 常用试剂配制
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 甘薯AGPasea1和AGPasea2基因长全的获得
• 3.2.2 植物双元表达载体的构建
• 3.2.3 根癌农杆菌的转化
• 3.2.4 遗传转化
• 第四章 结果与分析
• 4.1 RNA的提取结果
• 4.2 CDNA序列的获得
• 4.2.1 AGPa1和AGPa2的克隆与序列分析
• 4.2.2 AGPa1和AGPa2的生物信息学分析
• 4.3 载体构建
• 4.4 甘薯转基因植株的再生
• 4.4.1 无菌苗的获得
• 4.4.2 转基因植株的获得
• 4.5 烟草无菌苗的培养
• 4.5.1 烟草抗性植株的获得
• 4.5.2 转基因甘薯的PCR检测
• 第五章 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢