IgA肾病扁桃体细胞上清对肾系膜细胞及小管细胞的影响

论文摘要

IgA肾病（IgAN, IgA nephropathy）是一类以肾小球系膜区IgA沉积为主要特征的疾病,是最常见的原发性肾炎之一。病因不明,预后不佳,目前仍缺乏有效的治疗方法,每年约有1～2%的IgAN患者进入终末肾衰竭,需要肾脏替代治疗。加之本病好发于青少年,男多于女,给国家和个人带来了沉重的经济和社会负担。因此,对其病因和发病、疾病进展机制的研究成为全世界医学工作者尤其是广大肾病学者关注的热点之一。已有许多关于扁桃体与IgA肾病发病机制之间关系的报道。扁桃体的物理、化学或炎症的刺激常常加重IgA肾病患者的尿检异常,多项长期的临床病例随访研究的结果提示扁桃体切除可以改善IgA肾病患者的尿检异常并维持稳定肾功能,但其具体机制仍有待进一步阐明。较单纯慢性扁桃体炎患者（Chronic Tonsilitis, CT）,伴有IgA肾病患者的扁桃体单个核细胞（Tonsillar Mononuclear Cells, TMCs）及其分泌产物的异常已被多项研究证实。IgA肾病患者TMCs对抗原的反应明显强于对照组,受到刺激后可以分泌更多的炎症因子。IgA肾病患者扁桃体免疫细胞比例明显倒置,淋巴细胞在亚群比例、凋亡等方面表现异常,分泌IgA, pIgA的细胞明显增多,还可以生成低糖基化的IgA1分子（唾液酸和乳糖基明显减少）,与肾脏系膜沉积的IgA类型一致,并自主性高分泌IgA和TGF-β, IFN-γ等细胞因子,影响肾小球硬化的细胞因子MCP-1和抑制小管增殖的IL-8等细胞因子亦增加。IgAN患者TMCs在PHA刺激后的分泌产物除了对扁桃体自身免疫产生调节作用,是否会对人肾脏固有细胞,如肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞的生长与分化产生影响,与非IgAN的慢性扁桃体炎患者比较是否有明显差异,目前尚未见报道。前期的研究发现IgAN患者的外周血单个核细胞（periferal blood monouclear cells, PBMCs）培养上清与肾小球系膜细胞共培养可以上调ICAM-1表达,TMCs培养上清与系膜细胞共培养,较非IgAN慢性扁桃体炎患者,可以上调系膜细胞TGF-β1, PAI-1, IL-6的表达。单一的细胞因子作用研究很多,但体内环境复杂,不同的细胞因子共存时可能出现多效、重叠、拮抗或协同的作用。因此,在IgAN中,为了以接近体内的状况来观察TMCs及其产物在IgAN发病机制中的可能作用,我们收集IgAN和非IgAN漫性扁桃体炎患者手术切除的扁桃体,分离其中的TMCs并收集上清,直接作用于人肾小球系膜细胞（HMC）和人肾小管上皮细胞（HK-2）,并收集TMCs培养上清与HMC共培养后的上清再作用于HK-2细胞,观察这两种肾脏固有细胞间的相互联系及不同细胞培养上清液对人肾小球系膜细胞和肾小管上皮细胞的增殖与分化作用上的差异,并初步探讨相关可能机制,探索扁桃体免疫在IgAN发病、疾病进展中的可能作用。本研究共分为两部分第一部分IgA肾病患者TMCs培养上清对人肾小球系膜细胞凋亡及相关机制研究目的观察IgA肾病患者TMCs培养上清对人肾小球系膜细胞凋亡的影响及相关机制,探讨IgA肾病TMCs分泌产物在IgA肾病中的可能作用。方法收集13例IgAN和非IgAN CT患者手术摘除的右侧扁桃体,分离TMCs进行体外培养；各组病人均分PHA刺激和未刺激两小组培养,PHA体外刺激TMCs72小时,收集PHA刺激和未刺激的细胞培养上清液；将PHA刺激和未刺激的IgAN和非IgAN CT患者TMCs混合培养上清按所需浓度与人肾小球系膜细胞共培养24小时,流式细胞仪测定系膜细胞凋亡率,RT-PCR检测系膜细胞Bcl-2,Bax,Fas mRNA的表达；应用ELISA检测PHA刺激和未刺激的TMCs培养上清液中的TGF-β1水平。结果PHA刺激的IgAN患者TMCs上清与人肾小球系膜细胞共培养后,与阴性对照组、PHA刺激的非IgAN CT组、未刺激的IgAN和非IgANCT组相比,系膜细胞的凋亡率明显升高（P<0.05）。系膜细胞的Bcl-2/β-actin mRNA下调至阴性对照组的25%,Bax／Bcl-2比值增加至阴性对照组的4.3倍,与阴性对照组、PHA刺激的非IgAN CT组、未刺激的IgAN和非IgAN CT组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。IgA肾病患者TMCs PHA刺激的上清亦可使Fas/β-actin mRNA表达增加至阴性对照组的2.38倍,与阴性对照组、未刺激的IgAN和非IgAN CT组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。IgA肾病患者TMCs培养上清液中TGF-β1表达水平较非IgAN慢性扁桃体炎患者,明显升高（P<0.05）,但PHA刺激组与未刺激组两组之间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论1.IgAN的TMCs体外PHA刺激的培养上清与人肾小球系膜细胞共培养后能促进系膜细胞的凋亡,此机制可能与其下调系膜细胞Bcl-2基因表达,增加Bax／Bcl-2比例,上调Fas基因表达有关。2.IgA肾病患者的TMCs培养上清液中TGF-β1表达水平明显升高,PHA体外刺激不能显著诱导TMCs生成TGF-β1。IgAN患者TMCs培养上清液中的TGF-β1水平的高低可能与其增加系膜细胞凋亡率的作用无关。第二部分IgA肾病患者TMCs培养上清对人肾小管上皮细胞增殖、凋亡和转分化研究目的观察IgAN患者TMCs培养上清及其与人肾小球系膜细胞共培养后的相应系膜细胞上清对人肾小管上皮细胞增殖、凋亡和转分化的影响,探讨IgA肾病TMCs分泌产物在IgAN中的可能作用。方法将PHA刺激和未刺激的IgAN和非IgAN CT患者TMCs培养上清按20%浓度加入培基与人肾小球系膜细胞共培养24小时,收集不同TMCs相应的混合系膜细胞上清。不同浓度的TMCs培养上清及其相应的系膜细胞上清与HK-2细胞共培养,在12小时,24小时,用MTT比色法检测细胞增殖。TMCs培养上清及其相应的系膜细胞上清按所需浓度与HK-2细胞共培养24小时,采用流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡率的改变。采用RT-PCR检测HK-2细胞Bcl-2, Bax, E-cadherin和α-SMA mRNA的表达,采用Western Blot检测E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。结果PHA刺激的IgAN患者TMCs上清及其相应的系膜细胞上清以20%的浓度加入培基与HK-2细胞共培养24小时后,与阴性对照组、PHA刺激的非IgAN CT组、未刺激的IgAN和非IgAN CT组相比,HK-2细胞的存活率明显降低（P<0.05）,细胞凋亡率显著增加（P<0.05）,且细胞存活率随上清浓度的升高而降低,随作用时间的延长亦降低。PHA刺激的IgAN患者TMCs上清与HK-2细胞共培养后,HK-2细胞的Bcl-2/β-actin mRNA下降至阴性对照组的40%,Bax/Bcl-2比值增加至阴性对照组的2.41倍,与阴性对照组、未刺激的IgAN和非IgAN CT组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。亦可使HK-2细胞的E-cadherin/β-actin mRNA下降至阴性对照组的43%,与阴性对照组、未刺激的IgAN和非IgAN CT组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。并增加HK-2细胞的α-SMA mRNA表达,与阴性对照组、PHA刺激的非IgAN CT组、未刺激的IgAN和非IgAN CT组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。PHA刺激的IgAN患者TMCs相应的系膜细胞上清与HK-2细胞共培养后,可使HK-2细胞的Bcl-2/β-actin mRNA下调至阴性对照的47%,与阴性对照组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,并使Bax/Bcl-2比值增加至阴性对照组的2.23倍,与阴性对照组、PHA刺激的非IgAN CT组、未刺激的IgAN和非IgAN CT组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。亦可使HK-2细胞的E-cadherin/β-actin mRNA降低至阴性对照组的66%,并增加HK-2细胞的α-SMA mRNA表达,与阴性对照组、PHA刺激的非IgANCT组、未刺激的IgAN和非IgAN CT组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。在蛋白水平,PHA刺激的IgAN患者TMCs上清与HK-2细胞共培养后,HK-2细胞的E-cadherin/β-actin下降至阴性对照组的50%,与阴性对照组、未刺激的IgAN和非IgAN CT组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。并增加HK-2细胞的a-SMA蛋白表达,与阴性对照组比,差异有统计学意义（P<0.05）。PHA刺激的IgAN患者TMCs相应的系膜细胞上清与HK-2细胞共培养后,HK-2细胞的E-cadherin/β-actin下降至阴性对照组的47%,并增加HK-2细胞的a-SMA蛋白表达,与阴性对照组、PHA刺激的非IgAN CT组、未刺激的IgAN和非IgAN CT组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。结论PHA刺激后的IgAN的TMCs培养上清及其相应的系膜细胞上清与人肾小管上皮细胞共培养后,HK-2细胞增殖受抑,细胞凋亡率增加,此机制可能与其下调HK-2细胞Bcl-2基因表达,上调Bax/Bcl-2比值有关。PHA刺激后的IgAN TMCs的培养上清及其相应的系膜细胞上清亦可诱导HK-2细胞转分化,下调E-cadherin基因和蛋白表达,上调α-SMA基因和蛋白表达。肾小球系膜细胞和小管上皮细胞间可能在IgAN患者中存在交互关系。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写词
• 前言
• 第一部分 IgA肾病患者TMCs培养上清对人肾小球系膜细胞凋亡及其机制研究
• 1 材料和方法
• 2 统计分析
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 第二部分 IgAN患者TMCs培养上清对人肾小管上皮细胞增殖、凋亡和转分化研究
• 1 材料和方法
• 2 统计分析
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 综述
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果