Borealin/CDCA8的生物学功能研究

论文摘要

Borealin是最近新发现的一个染色体过客复合物其作用可能是在纺锤体与染色体的结合以及染色体分离的过程中起重要作用。ChIPon Chip是在染色质免疫共沉淀的基础上发展起来的一门染色质免疫共沉淀和芯片技术相结合的新技术。染色质免疫共沉淀可以系统全面的研究转录因子DNA结合蛋白等在细胞和组织器官内的真实结合情况,但是其研究的局限性在于研究的通量太小。芯片技术的特点是高通量,规模化,因此二者结合后可以大规模的研究转录因子在全基因组水平的调节控制作用。本研究主要利用RT-PCR,Western blot,抗体封闭,ChIP on Chip以及荧光素报告基因系统等技术研究了Borealin在不同组织器官中,胚胎早期发育,干细胞分化前后的表达差异,以及Borealin的DNA结合能力,及其在10,13,14,17号染色体上的结合情况。系统的说明了Borealin基因的本质,初步说明了Borealin在胚胎发育和胚胎干细胞中的重要作用。成功的运用ChIP on Chip技术寻找到Borealin的可能下游基因,并用荧光报告基因和荧光定量PCR技术证明了Borealin对这些基因的调节作用。研究分为三部分,实验方法和结果如下:第一部分Borealin在小鼠多组织,干细胞及早期胚胎中的表达RT-PCR,Western blot结果表明Borealin在小鼠睾丸,卵巢,肠以及眼睛的组织中Borealin的表达量较其他组织要偏高,人胚胎干细胞用RA（视黄酸）诱导分化7天和自然分化后,在Oct4基因的表达急剧下降的同时,Borealin和Survivin基因的表达出现了非常明显的下降。在小鼠胚胎干细胞中也得到相同的结论。Borealin基因在小鼠胚胎受精卵,2细胞,4细胞,8细胞,囊胚各个时期均有表达。全胚胎原位杂交结果说明8.5-9.5dpc的小鼠胚胎中Borealin的表达除了内脏区域外都有表达,但是信号主要集中在脑部区域。结果提示Borealin在干细胞和早期发育过程中有其特殊的作用。第二部分显微注射Borealin抗体导致小鼠胚胎发育停滞为了进一步了解Borealin在小鼠胚胎发育中的作用,Borealin抗体被显微注射到ICR小鼠的受精卵中,观察封闭Borealin后对小鼠胚胎发育的影响。6小时后所有胚胎都发育到了2细胞,两组之间没有明显差异。48-72小时后,实验组（注射抗体）的胚胎绝大部分都在2-4细胞期停止了发育。而对照组注射IGg后的胚胎都顺利的发育到了桑葚胚时期和囊胚期。所有数据经过SPSS 10.0处理,除了在2细胞期外,两组之间都有显著性差异P＜0.05。而注射抗体后细胞在分裂时纺锤体和染色体形成的染色体过客复合物在相互间的定位出现紊乱,同时细胞中出现多核现象。说明Boralin对早期的小鼠胚胎发育是必须的。其功能性缺失对小鼠早期胚胎发育是致死的。第三部分Borealin结合DNA研究及利用ChIP on Chip研究Borealin在基因组上的结合位点我们得到Chr10上的结合位点137个,Chr13上的结合位点115个,Chr14上的结合位点83个,Chr17上的结合位点113个,合计448结合位点。通过MEME-Motif discovery tool处理得到ACTCCCAGCTTCAAGGGAGGCTGAGGCCTGAGCCTCCCTAGAAGCTGGGA命名为MZ的序列结构。通过UCSC分析得到的Borealin在10,13,14,17四条染色体上的结合位点情况,我们找到了35个潜在的下游基因。其中10号染色体上8个,其中13号染色体上3个,其中14号染色体上6个其中17号染色体上18个。为了进一步确定通过ChIP on Chip所得到的DNA结合位点是否真实,结合位点的下游基因的功能与纺锤体和染色体的分离等功能相关。我们挑选了CBX4,7HSD,CDKN3,EIF4BP2,IPO4,WAC,TOB1,Survivin 8个基因,在MCF-7细胞和人胚胎赶细胞中分别进行独立的染色质免疫共沉淀,结果表明它们在这两种细胞中都有非常明显的结合。Borealin经过RNAi处理表达下降时,我们用荧光定量PCR技术来确定结合位点下游基因的表达在干扰前后是否发生了变化时,结果显示MCF-7细胞在Borealin的表达受干扰下降时,17HSD,CBX4,TOB,CDKN3以及Survivin的表达出现明显的下调,但是WAC,EIF4EBP2,RPS6KA5的表达量变化不明显。过量表达Borealin对CBX4等基因启动子的促进转录作用。将MZ以及CBX4,IPO4等基因上游的结合位点克隆到PGL3-Basic质粒后将其与Borealin基因共转染MCF-7细胞,结果表明过量表达Borealin对CBX4,CDKN3,EIF4BP2,17HSD等基因的结合位点有明显的激活作用。综上所述,Borealin特异性的高表达于未分化的胚胎干细胞和睾丸,卵巢及8.5-9.5dpc的小鼠胚胎脑部。Borealin还能特异的结合到CBX4等基因的启动子区域,并促进这些基因的表达。这些充分说明Borealin除了具有染色体过客的功能还有一定的结合DNA促进基因的转录表达的作用。这对我们进一步了解Borealin在细胞和早期发育中的作用具有指导意义。本研究第一次运用ChIP on Chip的方法成功的在10,13,14,17号染色体筛选到Borealin的候选下游基因,第一次明确证明Borealin具有结合DNA的能力并且找到了Borealin一个结合DNA结构。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 技术路线图
• 第一章 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 细胞系
• 1.1.3 质粒和细菌
• 1.1.4 引物
• 1.1.5 主要抗体
• 1.1.6 主要试剂/试剂盒
• 1.1.7 主要仪器和设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 细胞DNA的提取
• 1.2.2 细胞或组织总RNA的提取与表达谱芯片实验
• 1.2.3 囊胚的收集及囊胚RNA的提取
• 1.2.4 RNA中痕量DNA的去除
• 1.2.5 Borealin体外结合DNA实验
• 1.2.6 两步法RT-PCR
• 1.2.7 ES细胞培养
• 1.2.8 RNA合成
• 1.2.9 DNA克隆
• 1.2.10 RNAi质粒的构建
• 1.2.11 报道基因和siRNAs瞬时转染细胞
• 1.2.12 小鼠超排及抗体核内注射
• 1.2.13 免疫组化
• 1.2.14 报道基因荧光素酶活性分析
• 1.2.15 BCA法蛋白定量
• 1.2.16 细胞总蛋白提取和Western blotting分析
• 1.2.17 全胚胎原位杂交方法
• 1.2.18 间接免疫荧光法的步骤
• 1.2.19 稳定表达Borealin RNAi的MCF-7细胞系的建立
• 1.2.20 抗体纯化
• 1.2.21 染色质免疫沉淀-芯片实验
• 1.2.22 统计学处理
• 第二章 实验结果
• 2.1 Borealin及CPC相关基因在小鼠多组织及ES中的表达
• 2.1.1 Borealin,Survivin在小鼠多组织中的表达
• 2.1.2 Borealin在小鼠植入前胚胎及ES细胞中的表达
• 2.2 全胚胎原位杂交
• 2.3 Borealin在早期胚胎发育的作用
• 2.3.1 Borealin抗体阻止了小鼠胚胎的发育
• 2.3.2 Borealin影响胚胎细胞的核型和CPC复合物的形成
• 2.4 Borealin体外结合DNA
• 2.5 ChIP on Chip
• 2.5.1 Borealin结合位点的生物信息学分析
• 2.5.2 结合位点下游基因的分析
• 2.6 ChIP检测MCF-7和ES中Borealin的结合
• 2.7 RNAi处理MCF-7细胞后Borealin下游基因的表达变化
• 2.8 Borealin对结合位点的转录促进作用化
• 第三章 讨论
• 3.1 Borealin的差异性表达
• 3.2 ChIP on chip
• 3.3 Borealin结合DNA并且结合到特殊基因的启动子区域
• 3.4 Borealin在转录表达方面的调节作用
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果目录及附件