α-鹅膏毒肽给药小鼠差异表达基因的鉴定及其拮抗药物的筛选

论文题目: α-鹅膏毒肽给药小鼠差异表达基因的鉴定及其拮抗药物的筛选

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 刘军

导师: 杨志荣

关键词: 鹅膏毒肽,鳞柄白毒鹅膏菌,反向,抑制消减杂交,差异表达基因,拮抗药物

文献来源: 四川大学

发表年度: 2005

论文摘要: 四川省及四川周边地区因为其独特的地理和生态环境,具有丰富的蕈菌资源。通过筛选富含α-鹅膏毒肽物质的毒蕈,从中分离鉴定α-鹅膏毒肽,并研究α-鹅膏毒肽在蕈菌的分布情况等,为进一步研究和生产α-鹅膏毒肽提供理论基础。再通过分析α-鹅膏毒肽在中毒小鼠体内的分布,初步探讨它在动物体内的代谢情况。在毒蘑菇中毒事件的事发地采集到相关蕈菌,对其进行小鼠毒性实验,证明其含有致死毒素,进一步对其进行形态学和分类学等研究,确定为鳞柄白毒鹅膏菌。利用反相高效液相色谱法从中分离到了α-鹅膏毒肽,此即为一种主要致死毒素。在本论文实验条件下,我们绘制出α-鹅膏毒肽浓度标准曲线及回归方程Y=5159X+1097.4。然后对鳞柄白毒鹅膏菌子实体中的α-鹅膏毒肽总含量及在子实体中的分布情况进行了研究,通过与标准曲线及回归方程方程的对比和计算,结果显示α-鹅膏毒肽总含量为2833.8ug/g干子实体。α-鹅膏毒肽在子实体中的分布具有环境因子特异性和组织特异性。论文对不同蕈菌采集地区的鳞柄白毒鹅膏菌中α-鹅膏毒肽含量研究发现,三江自然保护区的鳞柄白毒鹅膏菌中α-鹅膏毒肽含量最高,其次分别为重庆綦江县、雅安市、大邑县和彭县。蕈菌子实体中各部分组织中α-鹅膏毒肽含量的研究结果显示,菌褶中α-鹅膏毒肽含量最高,约占α-鹅膏毒肽总量的51.09%,且在单位组分中,α-鹅膏毒肽的量也最高,约至菌褶组分干重的0.29%。论文对尾静脉给药半致死计量α-鹅膏毒肽的小鼠的组织进行RP-HPLC分析,结果发现,对动物体组织中α-鹅膏毒肽的分布和代谢情况的

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第一章 α-鹅膏毒肽的分布研究及代谢初探

摘要

前言

1 材料和方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 药品与试剂

1.1.2 实验材料

1.1.3 主要仪器

1.2 方法

1.2.1 鳞柄白毒鹅膏菌的采集和鉴定

1.2.2 材料处理与蕈菌抽提液制备

1.2.3 色谱条件

1.2.4 标准曲线制备

1.2.5 精密度试验

1.2.6 α-鹅膏毒肽的分离与鉴定

1.2.7 三种蕈菌的RP-HPLC分析比较

1.2.8 A.virosa生长环境对子实体中α-鹅膏毒肽含量的影响

1.2.9 α-鹅膏毒肽在A.virosa子实体各部分中含量分布研究

1.2.10 α-鹅膏毒肽在小鼠体内的代谢研究

2 结果

2.1 鳞柄白毒鹅膏菌的鉴定

2.2 标准曲线制备

2.3 标准曲线整合

2.4 精密度检测

2.5 RP-HPLC分离纯化α-鹅膏毒肽

2.6 三种蕈菌的RP-HPLC分析比较

2.7 A.virosa生长环境对子实体中α-鹅膏毒肽含量的影响

2.8 A.virosa子实体各组分中α-鹅膏毒肽的分布

2.9 α-鹅膏毒肽在小鼠体内的代谢初探

3 讨论

3.1 鳞柄白毒鹅膏菌的采集和鉴定

3.2 标准曲线制备

3.3 精密度检测

3.4 RP-HPLC技术分离α-鹅膏毒肽

3.5 三种蕈菌的RP-HPLC分析比较

3.6 A.virosa生长环境对子实体中α-鹅膏毒肽含量的影响

3.7 A.virosa子实体各组分中α-鹅膏毒肽的分布

3.8 α-鹅膏毒肽在小鼠体内的代谢初探

参考文献

第二章 应用抑制消减杂交筛选α-鹅膏毒肽差异表达基因

摘要

前言

1 材料和方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 菌株

1.1.2 质粒载体

1.1.3 试剂及试剂盒

1.1.4 实验动物

1.1.5 细菌培养用培养基

1.1.6 常用溶液和缓冲液

1.1.7 引物合成

1.1.8 实验仪器

1.2 方法

1.2.1 小鼠α-鹅膏毒肽中毒试验对象建立

1.2.2 给药前后总RNA的纯化

1.2.3 SMART技术合成cDNA

1.2.4 抑制消减杂交

1.2.5 差减cDNA的克隆和分析

2 结果

2.1 实验对象的确立

2.2 总RNA的质量分析

2.3 抑制消减杂交

2.3.1 总cDNA的合成

2.3.2 DNA纯化效率检测

2.3.3 cDNA的检测

2.3.4 酶切效果检测

2.3.5 Adaptor连接效率检测

2.3.6 NestedPCR扩增消减杂交产物

2.4 差减cDNA的克隆和分析

2.4.1 PCR筛选差减文库

2.4.2 斑点杂交分析

2.4.3 差异cDNA片段的序列分析

3 讨论

3.1 SMART技术合成cDNA

3.2 SSH实验中涉及的RsaI酶切

3.3 SSH实验中涉及的接头连接

3.4 SSH实验中涉及两轮杂交反应

3.5 SSH实验中涉及的两轮PCR反应

3.6 应用SSH技术筛选α-鹅膏毒肽差异表达基因的意义

参考文献

第三章 抗α-鹅膏毒肽药物筛选

摘要

前言

1 材料和方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 药品

1.1.2 试剂及试剂盒

1.1.3 实验动物

1.1.4 常用溶液和缓冲液

1.1.5 引物合成

1.1.6 实验仪器

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组

1.2.2 待筛选拮抗药物制备

1.2.3 α-鹅膏毒肽作用小鼠建立及药物干预

1.2.4 药物干预后小鼠的临床症状观察

1.2.5 药物干预对小鼠体重的影响

1.2.6 半定量PCR检测对象的建立

1.2.7 α-鹅膏毒肽毒性作用相关基因在药物干预后转录变化情况

2 结果

2.1 药物干预后小鼠的临床症状观察

2.2 待筛选拮抗药物对小鼠体重的影响

2.3 半定量PCR检测对象的建立

2.4 α-鹅膏毒肽毒性作用相关基因在药物干预后转录变化情况

3 讨论

3.1 代表基因的选择

3.2 候选拮抗药物的筛选

3.3 候选拮抗药物对α-鹅膏毒肽毒性作用的影响

参考文献

文献综述

第一节 毒蘑菇的分类与作用

第二节 抑制消减杂交SSH技术研究进展

第三节 半定量RT-PCR技术研究进展

参考文献

致谢

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发布时间: 2005-10-08

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