盐芥耐盐相关基因的克隆及功能分析

论文摘要

盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤中高浓度的Na+对许多高等植物的生长和发育造成很大的伤害。盐胁迫对植物的伤害主要由两方面的因素引起：一是离子胁迫，大量的Na+进入到植物体内，不但打破了体内原有的离子平衡，而且影响了细胞的代谢和细胞的K+／Na+比率，造成MDA积累及膜脂和膜蛋白损伤；二是渗透胁迫，盐分使土壤中的水势降低，从而引起植物体的水分缺乏。目前，植物中用来消除Na+毒害的策略主要包括：减少外界Na+的吸收，Na+的外排和Na+的区隔化。目前虽然已知Na+可能是通过根的一些K+通道进入到植物细胞，但是具体的分子机制仍待于进一步研究。根系细胞Na+外排主要是通过定位于细胞质膜的Na+／H+antiporter转运蛋白来完成的。Na+区隔化是植物细胞利用H+浓度梯度通过定位于液泡膜的Na+／H+antiporter转运蛋白将细胞质中的Na+转运到液泡中，一方面降低了细胞质中Na+的浓度，减少过量Na+对植物细胞的损害，另一方面可以维持植物细胞的膨压，增加植物细胞吸水和保水的能力。 随着植物分子生物学的发展，人们通过对拟南芥的研究，在植物耐盐和耐早方面取得重大的研究成果，特别是对植物在胁迫条件下的信号转导、转录水平的调控、胁迫条件下离子的渗透平衡、细胞的抗氧化作用、渗透保护物质的合成等诸多方面都有了较为深入的了解。但是拟南芥是一种典型的非盐生植物，作为耐盐和耐旱机制研究的模式植物有一定的局限性。盐芥（Thellungiellasalsuginea or Thellungiella halophila）是拟南芥的近缘物种，是一种高度耐盐耐旱的盐生植物。该种植物在盐胁迫的前后既不产生盐腺也没有形态上的明显变化，表明其耐盐性在很大程度上取决于该物种的基本生理及其生化机制。而且盐芥具有cDNA序列与拟南芥相似程度高、基因组小等优点，近几年来逐渐成为人们研究植物非生物胁迫的模式植物。本研究以盐芥作为实验材料，分别构建了盐芥的小片段基因组文库以及盐胁迫处理的cDNA文库。分别克隆了盐芥盐胁迫诱导基因TsVP和Na+／pi转运体基因及其启动子序列，并对这两个基因的功能及表达模式进行了研究。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1.1 耐盐相关基因的研究进展
• 1.1.1 耐盐相关信号转导基因
• 2+信号'>1.1.1.1 Ca²⁺信号
• 1.1.1.2 MAPK参与的信号转导途径
• 1.1.1.3 磷脂酶信号转导系统
• 1.1.1.4 其它蛋白激酶参与的信号转导途径
• 1.1.2 离子转运及离子渗透平衡相关基因
• +渗透平衡调节'>1.1.2.1 Na⁺渗透平衡调节
• +渗透平衡调节'>1.1.2.2 K⁺渗透平衡调节
• 2+渗透平衡调节'>1.1.2.3 Ca²⁺渗透平衡调节
• -离子渗透平衡调节'>1.1.2.4 盐胁迫条件下的Cl^-离子渗透平衡调节
• 1.1.3 渗透保护物质（相溶性溶质）的合成和水通道蛋白
• 1.1.3.1 渗透保护物质
• 1.1.3.2 胚胎晚期丰富蛋白（LEA）
• 1.1.3.3 植物水通道蛋白
• 1.1.4 胁迫相关转录因子及顺式作用元件
• 1.1.4.1 胁迫相关转录因子
• 1.1.4.2 胁迫相关顺式作用元件
• 1.1.5 细胞抗氧化及活性氧清除相关基因
• 1.2 盐芥的研究进展
• 1.2.1 盐芥和拟南芥在胁迫条件下转录物组变化的比较
• 1.2.2 离子运输和渗透平衡
• 1.2.3 盐胁迫条件下生化反应
• 1.2.4 盐芥正成为耐盐耐旱研究的模式植物
• 1.3 本研究的目的和意义
• +-PPase基因的克隆和功能分析'>第二章 盐芥H⁺-PPase基因的克隆和功能分析
• +-PPase研究进展'>2.1 H⁺-PPase研究进展
• +-PPase活性的影响'>2.1.1 各种阳离子对H⁺-PPase活性的影响
• +-PPase基因的克隆'>2.1.2 H⁺-PPase基因的克隆
• +-PPase基因表达和活性水平的调控'>2.1.3 H⁺-PPase基因表达和活性水平的调控
• 2.2 实验材料和方法
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 菌株及其质粒载体
• 2.2.3 实验方法
• 2.2.3.1 盐芥总RNA的提取
• 2.2.3.2 mRNA的分离
• 2.2.3.3 盐芥cDNA文库构建
• 2.2.3.4 盐芥小片段基因组文库的构建
• +-PPase基因cDNA片段的分离'>2.2.3.5 H⁺-PPase基因cDNA片段的分离
• 2.2.3.6 盐芥cDNA文库筛选
• 2.2.3.7 盐芥小片段基因组文库筛选
• +-PPase基因AVP1的克隆'>2.2.3.8 拟南芥H⁺-PPase基因AVP1的克隆
• 2.2.3.9 Southern blot分析
• 2.2.3.10 Northern blot分析
• +-PPase基因的表达模式'>2.2.3.11 Real-time RT-PCR分析H⁺-PPase基因的表达模式
• 2.2.3.12 酵母突变体功能互补分析
• 2.2.3.13 各种质粒的重组和鉴定
• 2.2.3.14 重组质粒的农杆菌转化
• 2.2.3.15 农杆菌介导的烟草遗传转化
• 2.2.3.16 转基因烟草的分子生物学检测
• +-PPase酶活性的测定'>2.2.3.17 转基因烟草H⁺-PPase酶活性的测定
• 2.2.3.18 转基因烟草的耐盐性测试
• 2.2.3.19 转基因烟草的耐旱性测试
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 盐芥RNA的提取和cDNA合成
• 2.3.2 盐芥cDNA文库的滴度、重组率及平均插入片段大小
• 2.3.3 盐芥基因组文库
• +-PPase cDNA片段的克隆'>2.3.4 盐芥H⁺-PPase cDNA片段的克隆
• +-PPase cDNA基因的克隆'>2.3.5 盐芥H⁺-PPase cDNA基因的克隆
• 2.3.6 盐芥Tsvp基因的序列分析
• 2.3.7 盐芥TsVP基因启动子序列的克隆和生物信息学分析
• 2.3.8 盐芥TsVP基因的Southern blot分析
• +-PPase基因在拟南芥和盐芥中的表达模式'>2.3.9 盐胁迫条件下H⁺-PPase基因在拟南芥和盐芥中的表达模式
• 2.3.10 TsVP和AVP1在酵母突变体enal中的功能比较
• 2.3.11 TsVP和AVP1转基因烟草的获得
• +-PPase的活性检测'>2.3.12 V-ATPase和H⁺-PPase的活性检测
• 2.3.13 转基因烟草的溶质渗透势
• 2.3.14 转基因烟草耐盐性分析
• 2.3.14.1 TsVP和AVP1转基因烟草叶盘的耐盐性
• 2.3.14.2 盐胁迫条件下烟草叶肉原生质体活力测试
• 2.3.14.3 TsVP和AVP1转基因烟草在盐胁迫条件下生物量的变化
• +吸收速率'>2.3.14.4 转基因烟草叶盘有较快的Na⁺吸收速率
• 2.3.14.5 烟草组织中的离子含量和细胞膜损伤程度
• 2.3.15 TsVP转基因烟草的耐旱性分析
• 2.3.15.1 烟草种子萌发实验
• 2.3.15.2 干旱胁迫条件下烟草的形态变化和相对水含量
• 2.3.15.3 可溶性总糖、游离氨基酸和溶质渗透势变化
• 2.3.15.4 干旱胁迫对叶片细胞膜损伤和MDA含量的影响
• 2.4 讨论
• +依赖性磷转运体的克隆及酵母中的异源表达'>第三章 盐芥Na⁺依赖性磷转运体的克隆及酵母中的异源表达
• 3.1 植物磷转运体的研究进展
• 3.1.1 Pht1基因家族
• 3.1.2 Pht2基因家族
• 3.1.3 线粒体中的Pht3基因家族
• 3.1.4 植物细胞内质体中的磷转运体基因
• +/Pi转运体'>3.1.5 植物中的Na⁺/Pi转运体
• 3.2 材料和方法
• +依赖性磷转运体基因的克隆'>3.2.1 盐芥Na⁺依赖性磷转运体基因的克隆
• +依赖性磷转运体基因片段的克隆'>3.2.1.1 盐芥Na⁺依赖性磷转运体基因片段的克隆
• +依赖性磷转运体基因全长序列'>3.2.1.2 RACE方法克隆盐芥Na⁺依赖性磷转运体基因全长序列
• 3.2.1.3 全长cDNA序列的获得和生物信息学分析
• +依赖性磷转运体启动子序列的克隆'>3.2.2 盐芥Na⁺依赖性磷转运体启动子序列的克隆
• +依赖性磷转运体基因的表达模式分析'>3.2.3 盐芥Na⁺依赖性磷转运体基因的表达模式分析
• +依赖性磷转运体基因酵母表达载体的构建'>3.2.4 Na⁺依赖性磷转运体基因酵母表达载体的构建
• +依赖性磷转运体在酵母和拟南芥中亚细胞定位载体的构建'>3.2.5 Na⁺依赖性磷转运体在酵母和拟南芥中亚细胞定位载体的构建
• 3.2.5.1 拟南芥中亚细胞定位载体的构建
• 3.2.5.2 酵母中亚细胞定位载体的构建
• +依赖性磷转运体启动子序列的生物信息学分析和系列缺失植物表达载体的构建'>3.2.6 Na⁺依赖性磷转运体启动子序列的生物信息学分析和系列缺失植物表达载体的构建
• 3.2.7 盐芥和拟南芥的转化和筛选
• 3.2.7.1 拟南芥的遗传转化
• 3.2.7.2 转基因拟南芥植株的筛选
• 3.2.8 酵母遗传转化及转基因酵母的PCR筛选
• +依赖性磷转运体在酵母中异源表达的磷吸收实验'>3.2.9 Na⁺依赖性磷转运体在酵母中异源表达的磷吸收实验
• 3.2.9.1 酵母YPD低磷培养基的配制
• 3.2.9.2 酵母在低磷培养基上的培养
• 3.2.9.3 酵母生长速率和酸性磷酸酶活性的测定
• 3.2.9.4 酵母无机磷酸盐吸收实验
• 3.3 实验结果
• +依赖性磷转运体基因的克隆'>3.3.1 盐芥Na⁺依赖性磷转运体基因的克隆
• +依赖性磷转运体基因的生物信息学分析'>3.3.2 盐芥Na⁺依赖性磷转运体基因的生物信息学分析
• +依赖性磷转运体蛋白结构的生物信息学分析'>3.3.3 盐芥Na⁺依赖性磷转运体蛋白结构的生物信息学分析
• +依赖性磷转运体基因启动子序列的克隆及生物信息学分析'>3.3.4 盐芥Na⁺依赖性磷转运体基因启动子序列的克隆及生物信息学分析
• 3.3.5 启动子系列缺失突变体:GUS植物表达载体的构建
• +依赖性磷转运体基因的表达模式'>3.3.6 盐芥Na⁺依赖性磷转运体基因的表达模式
• +依赖性磷转运体的植物细胞亚细胞定位'>3.3.7 盐芥Na⁺依赖性磷转运体的植物细胞亚细胞定位
• +依赖性磷转运体基因在酵母中的表达'>3.3.8 盐芥Na⁺依赖性磷转运体基因在酵母中的表达
• 3.3.8.1 酵母表达载体的构建
• 3.3.8.2 酵母在低磷培养条件下的生长速率和酸性磷酸酶活性
• +依赖性磷转运体活性的影响'>3.3.8.3 pH对盐芥Na⁺依赖性磷转运体活性的影响
• +依赖性磷转运体Km的测定'>3.3.8.4 盐芥Na⁺依赖性磷转运体Km的测定
• 3.4 讨论
• 第四章 总结和展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文目录