论文摘要
背景心肌重构（remodeling）是高血压的主要靶器官受损类型之一，是独立于血压的心血管疾病主要危险因素之一。作为高血压病引起的主要心脏病理改变，它能够影响心肌细胞对氧和营养物质的摄取；它不但引起心肌僵硬度增加、舒张功能下降，继而收缩功能减退，最终导致心力衰竭，还可引起心肌缺血和心源性猝死。声学密度技术（acoustic densitometry；AD）技术是近年发展起来的新型无创性超声诊断技术，是以超声背向散射积分为基础的一种定量方法。利用声学密度（AD）技术测定心肌密度，其大小可反映心肌纤维化的程度。细胞外基质的降解主要由基质金属蛋白酶（MMPs）调节，而MMPs降解胶原的活性受内源性金属蛋白酶抑制因子（TIMPs）的影响，MMPs-TIMPs的平衡对维持胶原的正常代谢有重要作用。因此，抑制心脏成纤维细胞的增殖及胶原的合成并促进其降解是预防与逆转心肌重构，改善心功能的关键环节。过氧化物酶体增殖物激活型受体（PPARs）是1990年发现的核激素受体超家族的新成员，PPARs亚家族包括PPARα、PPARβ／δ和PPARγ三个成员。其中PPARγ在心脏中表达丰富，参与脂肪生成和葡萄糖代谢。罗格列酮是PPARγ的合成配体，近年来有报道说PPARγ可抑制AP-1和NF—κB活性，改善压力负荷型左心室肥厚，但对原发性高血压模型引起的心肌重构的研究国内报道很少。本研究在综合分析心肌重构研究动态和细胞信号转导途径的基础上，提出PPARγ可抑制AP-1和NF—κB信号转导通路，进而调控MMP-9和TIMP-1的表达，减轻自发性高血压大鼠（SHR）心肌重构的假设，我们通过SHR这一动物模型，利用分子生物学、病理学、背向散射积分技术，观察PPARγ激动剂罗格列酮对SHR心肌重构的干预作用并阐明可能机制，寻找心肌重构治疗的新靶点，为PPARγ激动剂扩大新的应用领域，为药物干预心肌重构，从而逆转心肌重构及由心肌重构向心力衰竭的转化提供新思路。目的（1）探讨SHR心肌重构时心肌组织超微结构的改变和心功能的变化。（2）明确AP-1和NF—κB信号转导通路在SHR心肌重构发生和发展中的作用。（3）评价PPARγ激动剂罗格列酮对SHR心肌重构的抑制作用。方法20只8周龄雄性SHR大鼠，随即分为两组：罗格列酮组（SB组）、SHR阳性对照组（SN组），每组10只；10只同周龄雄性正常血压京都Wistar大鼠（WKY）作为正常对照组（W组）。SB组大鼠每天给予罗格列酮5mg·Kg-1溶于1.5ml蒸馏水中灌胃，SN组和W组给予等量蒸馏水灌胃，持续16周。观察（1）各组大鼠的收缩压（SBP）、心率（HR）、体重（BW）；（2）于实验开始和结束时行常规超声心动图检查；（3）于实验开始和结束时行声学密度检测；（4）左室相对质量（LVM／BW）的计算；（5）HE染色观察心肌组织形态；（6）应用Masson染色进行心肌组织间质胶原定量；（7）电镜观察心肌组织超微结构；（8）免疫组织化学检测心肌组织中c-Fos、c-Jun和NF—κB蛋白的表达；（9）实时定量RT-PCR法检测心肌组织中c-Fos、c-Jun、collagenⅠ、collagenⅢ、PPARγ、NF-κB、MMP-9、TIMP1的mRNA的表达并计算MMP-9／TIMP1比值（10）免疫共沉淀检测心肌组织中c-Fos、c-Jun蛋白的表达；结果1．各组大鼠基本情况整个实验过程中大鼠共死亡5只，其中W组2只，SN组2只，SB组1只。死亡原因是最初灌胃手法不熟练，死亡3只，行超声心动图过程中麻醉过深死亡2只。SB组收缩压较SN组降低（P＜0.01），与W组相比明显升高（P＜0.01）；SB组体重较SN组增加（P＜0.05），SB组与SN组体重均低于W组（P＜0.01）；三组大鼠心率无显著性差异（P＞0.05）。2．常规超声心动图检测实验前各组大鼠常规超声心动图各指标间没有统计学差异（P＞0.05）；24周末实验结束时SB组左室舒张末期内径（LVEDd）较SN组增大（P＜0.01），与W组相比减低（P＜0.01）；SB组室间隔舒张末期厚度（IVSTd）和左室后壁舒张末期厚度（LVPWTd）较SN组降低（P＜0.01）；与W组相比增加（P＜0.01）。SB组二尖瓣前向血流频谱E峰与A峰比值（E／A）较SN组增加（P＜0.05），与W组比较降低（P＜0.01）；SB组左室中层短轴缩短率（MFS）值与SN组相比增高（P＜0.01），而比W组降低（P＜0.01）；SB组左室短轴缩短率（FS）值与SN组、W组均无差别（P＞0.05）；射血分数（EF）值在三组间无显著性差别（P＞0.05）。3．声学密度参数检测实验前各组大鼠各声学密度参数间未见显著性差异（P＞0.05）；24周末实验结束时SB组室间隔、左室后壁IBS％值与SN组相比，均降低（P＜0.05），与W组相比升高（P＜0.05）；SB组室间隔、左室后壁的CVIB值比SN组增高（P＜0.05），而比W组降低（P＜0.05）。4．左室相对质量的改变罗格列酮干预后SB组LVM、LVM／BW低于SN组（P＜0.05，P＜0.01），但仍高于W组（P＜0.01）。5．HE染色观察心肌组织改变W组大鼠心肌细胞排列整齐，细胞核大小均一，胞浆染色均匀。SN组大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞核大小不规则，胞浆染色加深，细胞内可见心肌纤维断裂。SB组大鼠心肌细胞排列较为整齐，细胞核偶见大小不规则，细胞内心肌纤维断裂情况明显好转。6．Masson染色胶原含量的检测心肌细胞染色呈红色或黄色，间质胶原呈蓝绿色。W组胶原组织分布稀疏，相邻细胞的胶原纤维网完好，着色淡；SN组心肌内胶原组织明显增多，围绕心肌细胞的胶原纤维网断裂、排列紊乱；SB组胶原纤维较SN组明显减少，排列较规整。定量分析显示：SB组CVF、PVCA较SN组明显降低（P＜0.05），但比W组增加（P＜0.05）。7．透射电镜观察心肌超微结构的改变W组左室心肌组织细胞排列整齐，心肌细胞质膜连续、完整；粗细肌丝排列整齐，肌小节及明暗各带清晰可见；线粒体大小均一、圆形或椭圆形；细胞间质可见成纤维细胞和少量胶原纤维。SN组左室心肌组织细胞排列紊乱，质膜模糊、断裂；肌原纤维呈灶性溶解，肌丝扭曲、断裂，肌节对位不齐；线粒体肿胀、间质可见大量胶原纤维分布。SB组左室心肌组织总体较SN组明显好转，细胞排列较整齐；肌原纤维断裂、溶解现象好转；线粒体大小较一致，排列较规整，间质内胶原堆积明显好转。8．免疫组织化学染色分析（1） c-Fos：染色阳性信号为棕黄色颗粒，定位于心肌细胞胞核。W组心肌细胞核内几乎未见c-Fos的表达，SN组心肌细胞核内棕黄色颗粒较W组密集，阳性细胞数量明显高于W组（P＜0.01），SB组心肌细胞核内棕黄色颗粒较SN组明显减少，阳性细胞表达数量降低（P＜0.01）。（2） c-Jun：染色阳性信号为棕黄色颗粒，定位于心肌细胞胞核。W组心肌细胞核内几乎未见c-Jun的表达，SN组心肌细胞核内棕黄色颗粒较W组密集，阳性细胞数量明显高于W组（P＜0.01），SB组心肌细胞核内棕黄色颗粒较SN组明显减少，阳性细胞表达数量降低（P＜0.01）。（3） NF-κB：染色阳性信号为棕黄色颗粒，定位于心肌细胞胞浆。W组心肌细胞浆内几乎未见NF-κB的表达，SN组心肌细胞浆内棕黄色颗粒较W组密集，阳性细胞百分数明显高于W组（P＜0.01），SB组心肌细胞浆内棕黄色颗粒较SN组明显减少，阳性细胞百分数降低（P＜0.01）。9．实时定量RT-PCR检测c-Fos、c-Jun的mRNA表达水平与W组相比，SN组c-FosmRNA、c-JunmRNA、collagenⅠmRNA、collagenⅢmRNA、NF-κBmRNA表达明显增加（P＜0.01）；与SN组相比，SB组各个指标的mRNA表达明显下降（P＜0.01）。与W组相比，SN组PPARγmRNA表达明显减少（P＜0.01）；与SN组相比，SB组PPARmRNA表达明显增多（P＜0.01）与W组相比，SN组MMP-9mRNA表达明显减少（P＜0.01）；与SN组相比，SB组MMP-9mRNA表达增多（P＜0.01）。与W组相比，SN组TIMP1mRNA表达明显增加（P＜0.01）；与SN组相比，SB组TIMP1mRNA表达明显下降（P＜0.01）。与W组相比，SN组MMP-9／TIMP1明显降低（P＜0.01）；与SN组相比，SB组MMP-9／TIMP1升高（P＜0.01）10．免疫共沉淀—免疫印记检测c-Jun／c-Fos蛋白质二聚体、c-Jun蛋白质表达水平（1） c-Jun／c-Fos蛋白质二聚体表达水平比较：与W组相比，SN组c-Jun／c-Fos蛋白质二聚体表达水平明显增加（P＜0.01）；与SN组相比，SB组c-Jun／c-Fos蛋白质二聚体表达水平明显下降（P＜0.01）（2） c-Jun蛋白质表达水平比较：与W组相比，SN组c-Jun蛋白质表达水平明显增加（P＜0.01）；与SN组相比，SB组c-Jun蛋白质表达水平明显下降（P＜0.01）结论1．与同周龄WKY大鼠相比，24周SHR心肌左室相对质量增加，心肌间质和血管周围胶原纤维明显增生，即发生了心肌重构。2．研究结果证实罗格列酮可降低左室相对质量，减轻心肌间质和血管周围胶原纤维增生，抑制SHR心肌重构，改善心脏舒张和收缩功能。3．PPARγ激动剂罗格列酮通过激活PPARγ受体抑制NF-κB和AP-1等信号转导途径，进而调控MMP-9和TIMP-1的表达，减轻心肌重构。