论文摘要
遗传性非息肉病性结直肠癌（Hereditary nonpolyposis colorectal cancer,HNPCC）,是一种常染色体显性遗传性恶性肿瘤综合征,也称为Lynch综合症,其特征为早发性、微卫星不稳定性,同时伴其他肿瘤的危险性增高,包括子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌、泌尿系统癌、胰腺癌及小肠癌。其发生率占所有结直肠癌的2%～15%,外显率高达80%～90%。HNPCC主要由于以下4种错配修复（Mismatch Repair,MMR）基因（主要为hMLH1,hMSH2,hMSH6和hPMS2基因）的杂合性胚系突变所致。MMR基因突变导致其MMR蛋白功能失常,从而导致肿瘤的发生。在MMR过程中,hMSH2基因与hMSH6或hMSH3相互结合形成杂合的蛋白质复合物,协同参与识别和修复DNA复制过程中的任何差错,然后招募更大的蛋白复合物参与MMR通路;作为DNA错配修复通路中的另一个成员,hMLH1基因能与hMLH3、hPMS2或hPMS1结合,hMLH1蛋白本身没有活性,其在MMR过程中起分子媒娘的作用,招募其他DNA修复蛋白参与MMR过程。目前研究发现,检测到MMR基因胚系病理性突变是确诊HNPCC家系及家庭成员的分子遗传学金标准。虽然早在1990年就已提出筛查HNPCC可疑家系的临床诊断纲要和标准,并且这些标准也在不断更新。但是,并不是所有符合标准的家系都能检出MMR基因突变。因为这些符合临床标准的可疑家系尚不能最终诊断HNPCC,而只有检测到MMR基因的胚系病理性突变才是诊断HNPCC的金标准。已知hMSH2和hMLH1基因编码区的胚系突变占所有检出突变的HNPCC家系的45%～60%,而hMSH6基因突变占10%左右,其他基因的突变则非常罕见。本课题组先前已对24个符合AC、15个符合JC和19个BG标准的HNPCC家系先证者进行了hMSH2/hMLH1/hMSH6基因整个编码区胚系小突变和hMSH2/hMLH1/hMSH6/hPMS2基因大片段异常及hMLH1基因启动子胚系甲基化的研究,结果共发现29个家系存在MMR基因的胚系突变和2个hMLH1基因启动子胚系的完全甲基化（部分甲基化患者因不影响hMLH1蛋白表达,故未统计在内）,因此,在58个符合不同临床诊断标准的可疑HNPCC家系中hMSH2/hMLH1/hMSH6基因的总的胚系异常率约为53.4%（31/58）。所以,我们推测,那些未检出MMR基因胚系异常的一部分家系可能与其他致病基因如hPMS2基因有关。因此,这部分HNPCC家系先证者就是本课题研究的重点。过去,导致hPMS2基因胚系突变罕见于HNPCC很可能是由于其假基因（如PMS2CL）阻碍了人们的研究,因其具有与hPMS2基因相似的序列,但是却不被转录,因而没有功能。有资料显示,hPMS2基因第1～8外显子和第10外显子易于通过基因组测序筛查,而不受其假基因的干扰。而对于外显子9和第11～15外显子,不受假基因PMS2CL干扰却没那么容易。最近,Etzle和Clendenning等学者建议以RNA为基础或long-range PCR方法筛查这些外显子。本研究采用long-range PCR方法,探讨那些无hMLH1/hMSH2/hMSH6基因胚系突变（包括小突变和大片段异常）的HNPCC家系先证者中hPMS2基因的胚系小突变情况。此外,由于hMLH1基因产物能与hPMS2基因产物形成复合物,因而有研究显示,当hMLH1基因存在胚系异常时可导致hMLH1蛋白表达缺失,从而影响hPMS2蛋白表达情况,即在hMLH1基因胚系异常的肿瘤中常常出现hMLH1蛋白和/或hPMS2蛋白表达异常的现象。并且,在我们课题先前的研究中,有些先证者携带hMLH1基因突变,但是hMLH1蛋白却表达正常。因此,我们要在这部分患者中增加hPMS2蛋白的检测,其目的是探讨hPMS2蛋白表达能否预示其分子伴侣hMLH1基因的胚系异常情况。另外,一些文献报道BRAF基因热点突变V600E只发生于散发性结直肠癌（Colorectal Cancer,CRC）,而从不参与已确诊的或临床可疑的HNPCC家系,因此有人建议使用BRAF突变筛查HNPCC和散发性CRC。同时,由于在肿瘤的发生过程中,BRAF基因突变和KRAS基因突变具有相互的排他性,因此也被包含于本研究中。与散发性CRC相比,无论在发病机制、临床特征,乃至治疗方案的选择和随访方案的制定上,HNPCC都具有其特殊性。因此,区分HNPCC和散发性CRC具有重要的实际意义,同时有利于HNPCC的遗传学咨询。因此,本研究对于完善中国人HNPCC中MMR基因突变谱和制定适合于中国人HNPCC的筛查策略具有重要的意义。故本研究对上述几个部分的研究分别报告如下:第一部分中国人HNPCC家系先证者hPMS2基因胚系突变的测序研究目的:1.分析无hMSH2/hMLH1/hMSH6基因胚系突变（包括小突变及大片段异常）的中国人HNPCC先证者hPMS2基因胚系突变情况;2.评价hPMS2基因胚系突变检测对于HNPCC家系分子遗传学筛选作用。方法:收集经hMSH2/hMLH1/hMSH6基因胚系突变检测无突变的HNPCC家系26个,其中5个符合Amsterdam标准、10个符合日本标准和11个符合Bethesda指导纲要。收集各家系先证者外周血样本10ml以供提取基因组DNA。利用PCR技术分别扩增第6、7、8和10外显子,利用long-range PCR方法分别扩增包含第1～5、第9、第11～12和第13～15外显子的四个大片段,然后再以它们为模板分别扩增各外显子,PCR产物纯化后进行DNA测序,并对测序结果进行生物信息学分析,对检测到的新的错义突变采用130个正常人（均无肿瘤家族史）外周血基因组DNA进行PCR扩增和测序排除其是否是单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polyposis,SNP）,并对检测到的hPMS2基因的所有SNP进行分析。结果:在26个符合不同临床标准且无hMSH2/hMLH1/hMSH6基因胚系突变的HNPCC家系先证者中,检测到1个hPMS2基因的胚系突变,为发生于第11外显子密码子511处c.1532C＞T的错义突变,该突变在130个正常人群中共检测到3个相同位点相同形式的突变,该位点突变在正常人中的发生率约为2.3%（3/130）,为尚未报道过的新发现的非同义cSNP。经过DNA测序分析后,在26个HNPCC家系先证者中共检出27个位点、总计260个SNP。检出的已报道的hPMS2基因SNP位点主要分布于第2和5外显子（占检出SNP总数的53.1%）,其次为第7、11和15外显子区（占检出SNP总数的33%）,它们共占检出SNP总数的86.1%。其中第2外显子占30%（78/260）,第5外显子占23.1%（60/260）,第7外显子占10%（26/260）,第11外显子占9.2%（24/260）及第15外显子占13.8%（36/260）。而第1、3、6、8、9和10外显子均未检出任何基因异常。第2和第5外显子区域可能是hPMS2基因SNP的好发部位。结论:1.在无hMSH2/hMLH1/hMSH6基因胚系突变的HNPCC家系先证者中,hPMS2基因的胚系突变极少见,建议暂不列入HNPCC分子遗传学的筛选策略之中。2.发生于hPMS2基因c.1532C＞T的错义突变经正常人群验证后证实为国际上尚未报道的非同义cSNP。3.hPMS2基因第2和5外显子区可能是HNPCC患者hPMS2基因SNP发生的热点区域,其是否与HNPCC发病机制相关,尚值得深入探讨。第二部分遗传性非息肉病性结直肠癌hPMS2蛋白表达的研究目的:1.评价HNPCC家系先证者hPMS2蛋白表达情况。2.探讨hPMS2蛋白表达情况与hMLH1基因胚系异常的关系。方法:收集符合不同临床诊断标准的30个HNPCC家系（均为本课题组已完成hMLH1、hMSH2、hMSH6及hPMS2基因胚系突变及大片段缺失检测的家系先证者,其中5个家系先证者还检出有hMLH1基因启动子的胚系甲基化）先证者的肿瘤组织或肿瘤组织白片,采用EnVision二步法检测各先证者肿瘤组织的hPMS2蛋白表达情况。收集并整理上述30个HNPCC家系先证者先前的MSI检测资料、MMR基因胚系突变的检测资料及hMLH1基因启动子胚系甲基化的检测资料,同时收集2例正常肠粘膜组织作为hPMS2蛋白检测的阳性外对照。结果:30个HNPCC家系基本资料:30个HNPCC家系中,符合AC标准的17个（其中2个符合ACⅡ标准）,符合JC标准的6个,余7个符合BG标准。其中17个家系先证者先前已检出有MMR基因的胚系突变和5个家系有hMLH1基因启动子胚系甲基化,具体包括:已检出有hMSH2基因胚系突变的3个和有hMSH2基因大片段缺失的4个;有hMLH1基因胚系突变的有5个HNPCC家系6个突变（其中家系H68同时检出2个突变）和有hMLH1基因大片段缺失4个;有hMSH6基因胚系突变有3个家系和有hMSH6基因大片段缺失的1个;没有一个家系检出有hPMS2基因的胚系突变和/或大片段缺失或扩增。其中,家系H2同时存在hMSH2和hMLH1两个基因的突变,家系H36同时存在hMSH6基因突变和hMSH2基因大片段缺失,家系H45同时存在hMLH1基因突变和hMSH6基因的大片段缺失。家系H10和H29有hMLH1基因启动子胚系的完全甲基化,而家系H32、H42和H46有hMLH1基因启动子胚系的部分甲基化。但是,本研究第一部分检出有hPMS2基因胚系突变的H13家系因无肿瘤组织而未能进行MSI检测和hPMS2蛋白免疫组化的检测,故未能包含其中。除H20、H44、H48和H54这4位HNPCC家系先证者肿瘤组织显示微卫星稳定（Microsatellite stablility,MSS）外,其余家系的先证者肿瘤组织均呈高度微卫星不稳定性（Microsatellite-instability-high,MSI-H）。hPMS2蛋白免疫组化检测结果:30个HNPCC家系先证者的肿瘤组织中,除4个家系先证者表达结果无法判读外,共检测到4例hPMS2蛋白表达异常,其中失表达和弱表达各2例,并均表现为MSI-H表型,其中3例符合AC标准,1例符合JC标准,hPMS2蛋白表达异常率为15.4%（4/26）。并且,这4例hPMS2蛋白表达异常者均存在hMLH1基因胚系异常,具体包括:2例hPMS2蛋白失表达的家系分别为H6（有hMLH1基因胚系小突变）和H10（具有hMLH1基因启动子胚系的完全甲基化）,而2例hPMS2蛋白表达减弱的家系分别为H9（有hMLH1基因胚系大片段缺失）和H45（同时有hMLH1基因胚系小突变和hMSH2基因大片段缺失）。并且,本课题先前均已证实家系H6、H10和H45的先证者肿瘤组织均不表达hMLH1蛋白,而家系H9却正常表达hMLH1蛋白。以上结果提示,hMLH1基因的胚系异常使hMLH1蛋白表达异常,从而可影响hPMS2蛋白的表达。因此,hPMS2蛋白表达异常在一定程度上可以预测hMLH1基因有无异常,阳性预测率为100%（4/4）。结论:1.在我国HNPCC家系先证者中,hPMS2基因蛋白表达异常率低于hMSH2和hMLH1蛋白表达（40%～60%）及hMSH6蛋白表达的异常（24%）;2.hPMS2蛋白的表达异常可能为hMLH1基因的胚系异常所致,对发现hMLH1基因胚系异常具有一定的预示作用。因而在HNPCC家系的筛查中,加入hPMS2蛋白检测可以避免部分HNPCC家系及其家庭成员的漏诊。第三部分HNPCC家系与散发性结直肠癌BRAF/KRAS基因突变的研究目的:1.探讨HNPCC家系先证者和散发性CRC肿瘤组织中BRAF基因和KRAS基因的突变情况;2.结合hMLH1蛋白表达,比较HNPCC与散发性CRC中BRAF基因的突变情况,在国内首次探讨BRAF基因热点突变（V600E）对于HNPCC家系的分子遗传学筛选意义。方法:随机收集散发性CRC患者94例和符合不同临床诊断标准的HNPCC家系先证者40例（其中包括16个家系先前已证实存在MMR基因胚系小突变和大片段缺失及hMLH1基因启动子胚系甲基化）的存档肿瘤组织蜡块或组织库中的新鲜肿瘤组织块,并抽提基因组DNA,采用PCR方法扩增BRAF基因第11、15外显子和KRAS基因第2外显子,PCR产物纯化后进行DNA测序,并对测序结果进行生物信息学分析。同时收集2例正常肠粘膜组织作为散发性CRC患者进行hMLH1蛋白表达的阳性外对照。结果:BRAF基因突变情况:在94例散发性CRC中共检出2例BRAF基因突变,且均位于第15外显子（c.1799T＞A,V600E）,突变率为2.1%（2/94）。而40例HNPCC家系先证者在第11和15外显子中均未检出任何类型突变。KRAS基因突变情况:94例散发性CRC中,共检出33例患者存在KRAS基因突变,共发生了34个突变（患者07-7680同时发生G12V和V14G两个突变）,突变率为35.1%（33/94）,其中79.4%（27/34）为发生于密码子12的突变,17.6%（6/34）为发生于密码子13的突变（具体包含14个为G12D突变,11个G12V突变,6个G13D突变,2个G12S突变,1个V14G突变）。这些均为文献已报道过的突变类型,且没有一例患者同时伴有BRAF基因的突变即BRAF基因和KRAS基因突变具有相互的排他性。而40例HNPCC家系先证者中共检出5例KRAS基因突变（包括2个G12V突变、2个G13D突变和1个G12C突变）,突变率为12.5%（5/40）,其中1例HNPCC家系（H36）先证者先前已证实有hMSH2基因大片段缺失和hMSH6基因胚系突变。散发性CRC肿瘤组织hMLH1蛋白表达情况:94例散发性CRC中检出有3例患者hMLH1蛋白表达缺失（3.2%）,其中1例患者（07-7992）携带有KRAS基因突变,而检出携带BRAF基因突变的2例患者肿瘤组织的hMLH1蛋白均正常表达。结论:1.BRAF基因突变仅见于散发性CRC,检出BRAF基因热点突变V600E者可排除HNPCC,但BRAF基因突变阴性者不能排除散发性CRC,因此可作为HNPCC筛选策略的排除标记;2.HNPCC中KRAS基因突变率低于散发性CRC,且可发生于已确诊存在MMR基因胚系突变的HNPCC中;3.BRAF基因突变和KRAS基因突变具有相互的排他性。
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