抗犬瘟热病毒P1蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

论文摘要

犬瘟热（Canine distemper,CD）是由犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）引起的一种危害犬的高度接触性传染病。该病感染性强,发病率高,极易继发细菌、病毒感染或二次感染。虽然犬瘟热弱毒疫苗已广泛应用,但是随着CD宿主范围的不断扩大,疫苗株毒力的增强,以及新的强毒株的不断涌现,该病已成为危害犬、毛皮经济动物及野生动物的重大疫病之一。因此,及时对CD病畜做出确切的诊断,掌握治疗的最佳时机,是当前的重中之重。P基因由1655个核糖核苷酸组成,位于基因组的1742～3396核苷酸处。其中P基因包含两个部分重叠的阅读框架,编码三种蛋白,结构蛋白P,非结构蛋白V和C。P蛋白是CDV结构蛋白中第二大蛋白,具有聚合酶的功能,在接种病毒12h后可以检测出为磷酸化的P蛋白,是出现早,且持续存在的蛋白,且基因在该病毒的谱系中极为保守,将其作为诊断抗原或制备诊断抗体具有可行性。本研究以Ameirica 1型疫苗变异株为基础,在国内首次表达纯化了P1（232-507AA）蛋白,通过其中P间接免疫试验发现,在病毒感染细胞P蛋白存在细胞核,这大概与P蛋白转录复制功能分不开;以纯化的P1蛋白免疫BABL/c小鼠,制作单克隆抗体,得到两株特异性的单克隆抗体E9E4C10和E9F8D9,为IgG2b亚型。期间用纯化的CDV制备兔高免血清。对获得的单抗和多抗采用ProteinG柱纯化,一方面,以CDV多抗制备胶体金探针,以制作的两株单抗包被纤维素膜作为检测线,以商品化的羊抗兔IgG抗体作为控制线,制备胶体金免疫试纸条,检出病毒浓度为1×105.4TCTD50/ml;另一方面,选取两株单抗包被ELISA板,用生物素标记的犬瘟热兔高免血清检测,建立双抗体夹心检测病毒方法,病毒检出浓度为5X103.4 TCTD50/ml。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 病原学
• 1.2 流行病学
• 1.3 发病机理
• 1.4 临床及病理变化
• 1.5 预防及治疗
• 1.6 关于P 蛋白
• 1.7 犬瘟热诊断研究进展
• 1.8 单克隆抗体
• 1.8.1 单抗技术的基本原理
• 1.8.2 单克隆抗体技术的应用
• 1.9 胶体金技术
• 1.9.1 免疫胶体金快速诊断技术的基本原理
• 1.9.2 胶体金快速诊断技术的研究和应用
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株、细胞、载体、实验动物
• 2.1.2 试剂及试剂盒
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 实验所用溶液及其配置
• 2.2 方法
• 2.2.1 抗原的制备
• 2.2.1.1 病毒的分离培养
• 2.2.1.2 H 基因的测序及糖基化位点分析
• 2.2.1.3 引物设计
• 2.2.1.4 目的基因的扩增
• 2.2.1.5 重组表达质粒pET32a-P1 的构建
• 2.2.1.6 重组蛋白的表达、纯化及可溶性分析
• 2.2.1.7 重组蛋白的鉴定
• 2.2.2 单克隆抗体的制备
• 2.2.2.1 抗原的准备
• 2.2.2.2 免疫动物
• 2.2.2.3 间接ELISA 检测方法的建立
• 2.2.2.4 杂交瘤细胞的融合、筛选、克隆化及腹水制备
• 2.2.2.5 特异性鉴定
• 2.2.2.6 杂交瘤细胞株的特性鉴定
• 2.2.3 兔CDV 高免血清的制备及其与腹水型单克隆抗体纯化
• 2.2.3.1 CDV 在vero-DST 细胞的大量扩增
• 2.2.3.2 CDV 病毒毒量的确定
• 2.2.3.3 CDV 的纯化、浓缩
• 2.2.3.4 兔CDV 高免血清的制备
• 2.2.3.5 CDV 单抗、多抗的ProteinG 纯化
• 2.2.3.6 ELISA 方法测定单抗、多抗效价
• 2.2.4 双抗体夹心ELISA 和胶体金免疫层析试纸条
• 2.2.4.1 兔CDV 多抗的生物素标记
• 2.2.4.2 双抗体夹心ELISA 检测的基本程序
• 2.2.4.3 双抗体夹心ELISA 条件的优化
• 2.2.4.4 紫外-可见吸收光谱法鉴定胶体金溶液质量
• 2.2.4.5 标记蛋白的处理
• 2.2.4.6 抗体与胶体金结合的最佳pH 确定
• 2.2.4.7 抗体与胶体金结合的最佳浓度确定（May 氏法、OD 值曲线法）
• 2.2.4.8 胶体金探针的制备
• 2.2.4.8.1 胶体金的标记
• 2.2.4.8.2 胶体金探针的纯化
• 2.2.4.9 试纸条的组装
• 2.2.4.10 胶体金免疫试纸条的初步判定
• 3 结果与分析
• 3.1 抗原的制备
• 3.1.1 病毒分离培养
• 3.1.2 H 蛋白氨基酸序列及糖基化位点分析
• 3.1.3 基因的扩增及重组表达质粒pET32a-P1 的构建
• 3.1.4 重组蛋白的SDS-PAGE 分析
• 3.1.5 重组蛋白的western blot 鉴定
• 3.1.6 重组蛋白的ELISA 鉴定
• 3.1.7 间接荧光免疫试验
• 3.2 单克隆抗体的制备
• 3.2.1 抗原纯化定量
• 3.2.2 间接ELISA 检测方法的确立
• 3.2.3 杂交瘤细胞株的筛选
• 3.2.4 特异性鉴定
• 3.2.5 单克隆抗体效价、饱和工作浓度测定及亚类鉴定
• 3.2.6 单克隆抗体的稳定性鉴定
• 3.2.7 单克隆抗体的相对亲和力和抗原表位鉴定
• 3.3 兔CDV 高免血清的制备及其与腹水型单克隆抗体的纯化
• 3.3.1 CDV 扩增、浓缩
• 3.3.2 CDV 毒量的确定
• 3.3.3 单克隆抗体和兔高免血清纯化结果
• 3.3.3.1 UV 图和SDS-PAGE 电泳图
• 3.3.3.2 盐析图
• 3.3.4 抗体浓度测定
• 3.3.5 活性鉴定
• 3.4 双抗体夹心ELISA 和胶体金免疫层析试纸条
• 3.4.1 双抗体夹心ELISA 法条件的确定
• 3.4.2 双抗体夹心ELISA 方法检测效果的判定
• 3.4.3 胶体金溶液质量的判定
• 3.4.4 胶体金与抗体结合的最佳PH 和最佳浓度判定
• 3.4.4.1 最佳PH
• 3.4.4.2 最适浓度的确定
• 3.4.5 胶体金检测结果的判定
• 3.4.6 特异性检测结果
• 4 结论
• 5 讨论
• 6 参考文献
• 7. 致谢
• 8. 个人简介
• 9. 攻读硕士学位期间发表论文
• 硕士学位论文内容简介及自评