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单核细胞增多性李斯特菌PCR和PCR-ELISA检测方法的建立

2020-11-28阅读(832)

单核细胞增多性李斯特菌PCR和PCR-ELISA检测方法的建立

论文摘要

李斯特菌属（Listeria spp.）是一类革兰氏阳性菌,属内包括单核细胞增多性李斯特菌（L.monocytogenes）、绵羊李斯特菌（L.ivanovii）、英诺克李斯特菌（L.innocua）、威尔斯李斯特菌（L.welshimeri）、西尔李斯特菌（L.seeligeri）和格氏李斯特菌（L.grayi.）等6个种。李斯特菌在自然界中广泛存在,其中单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes,LM）对人和多种动物具有致病性,在国内外食品安全检测与控制中日益受到重视。LM在4℃的环境中仍可生长繁殖,是冷藏食品中威胁人类健康的主要病原菌之一。同时,单核细胞增多李斯特菌作为研究胞内菌感染和细胞免疫的良好模型,已经引起越来越多研究者的关注。目前,国内对LM的研究尚不深入,工作实践中使用的检验方法也主要采用二次增菌后分离鉴定,烦琐、费时,迫切需要建立敏感、特异、高通量的分子生物学检测方法。在LM中存在两个主要的毒力岛,即LIPI-1毒力岛（Listeria pathogenicity island 1）和LIPI-2（Listeria pathogenicityisland 2）,其中,IPIL-1也称为prfA基因簇,是主要毒力因素,由prfA、pica、hly、mpl、actA和plcB构成,由prfA进行表达调控。本研究旨在对食品中单核细胞增多性李斯特菌污染状况、LM的生物学特性、LIPI-1毒力岛全基因序列以及分子生物学检测方法进行研究,为系统开展LM致病机理研究、开发新型疫苗载体等工作奠定基础,为检验检疫工作提供检测技术支持,为开展食品中LM的防控提供依据。1.单核细胞增多性李斯特菌的分离鉴定与生物学特性研究按照检验检疫行业标准（SN/T0148.1-2005）对156个动物源性食品样品进行了LM的分离鉴定,从中分离到7株单核细胞增多性李斯特菌,表明在动物源性食品中存在LM污染,该结果将为进行食品中LM的风险评估等工作提供参考依据。以参考菌株CCTCCAB97021和C53004为参照,对LM分离菌株XFL0605进行了药敏试验、小鼠致病性试验(LD50测定)和溶血活性检测。在溶血素（LLO）溶血活性实验中,相同培养条件下,3个试验菌株培养上清中LLO的含量存在差异,但产生的单位浓度LLO活性相当,推测菌株XFL0605产生LLO的能力较参考菌株CCTCCAB97021和C53004 2株LM菌株弱。分离菌株XFL0605培养上清溶血活性与其它试验菌株相当,但小鼠毒力(LD50)方面较其它实验菌株略低,该菌对昆明鼠的LD50为2.58×105CFU/mL,推测该菌株致病性差异可能由于LLO等相关毒力因子的表达差异所致。试验结果还证明,溶血素在pH5.6时活性最高,在pH7.0时活性基本丧失。对实验菌株的药敏实验结果表明,分离菌株XFL0605对常用药物（氨苄青霉素、链霉素、氯霉素、卡那霉素、环丙沙星和诺氟沙星）敏感性较高,为在分子生物学改造研究中,选择抗性筛选标记提供了依据。为方便、精确的检测溶血素活性,建立了分光光度法检测LM溶血素（LLO）活性,本方法中绵羊红细胞（SRBC）浓度与A540相关系数为0.99995,表现出明显的线性关系,能够直接对LLO溶血活性进行量化分析。分离菌株XFL0605、2个参考菌株C53004和CCTCCAB97021培养上清半数溶血值(HC50)测定结果分别是18.85、19.68和21.38,与测定的LLO含量（分别为1.305、1.530和1.749mg/mL）的呈正相关性,表明3个LM菌株产生的单位含量LLO溶血活性相当,该结论在对3个菌株hlyA基因克隆测序后得到印证。本研究建立的分光光度法检测LM溶血素活性的方法具有相关系数高、敏感和判定客观的特点,较好的解决了菌株LLO溶血活性检测与鉴定问题,为进一步测定单核细胞增多性李斯特菌溶血素（LLO）编码基因表达产物活性检测奠定基础。同时,本研究还改进和建立了微量反应板梯度稀释法检测溶血素的方法,该方法直观、操作方便。2.单核细胞增多性李斯特菌分子生物学检测方法研究针对LM的IdyA基因设计特异性引物和探针,PCR扩增目的片段长度为348bp,建立了PCR和PCR-ELISA检测食品样品中单核细胞增多性李斯特菌的方法。本研究建立的PCR-ELISA方法中,在上游引物5’端标记生物素,核酸探针的3’端标记地高辛,将PCR扩增、核酸液相杂交以及酶联显色技术结合,实现扩增产物上标记的生物素与包被在微孔板上的链霉亲和素结合,标记有地高辛的探针与产物杂交,再与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体结合,经底物显色。经对试验菌株检测表明,PCR、PCR-ELISA方法检测单核细胞增多性李斯特菌能扩增出特异片段,其它李斯特属的绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌和格氏李斯特菌、大肠杆菌、葡萄球菌和沙门氏菌等扩增检测结果是阴性。对相关条件进行了优化,当NaOH浓度为0.3 mol/L,杂交时间60 min;酶反应时间为45 min时,结果较好,洗板液以pH7.4 TBS-T为最佳。与PCR产物电泳法检测比较,PCR-ELISA的敏感性是前者156倍以上,并适合批量样品的检测分析。对60个样品检测表明,与SN/T0148.1-2005方法（引用ISO11290-1:2004）相比,PCR和PCR-ELISA方法具有更高的敏感性,表明本方法可以用于肉类食品中单核细胞增多性李斯特菌的快速诊断,具有敏感、特异、快速,重复性良好,无溴乙锭污染以及适合批量检测等优点,进一步标准化后可望作为食品中单核细胞增多性李斯特菌的常规检测方法。3.单核细胞增多性李斯特菌IPIL-1全基因克隆与序列分析参考Genbank中的单核细胞增多性李斯特菌LIPI-1有关基因序列设计引物,分段扩增,再进行编码核苷酸序列拼接,克隆了单核细胞增多性李斯特菌分离菌株XFL0605 LIPI-1毒力岛全基因,序列全长为8558bp,Accession No.EF661572,包括了完整的prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB等6个基因。对单核细胞增多性李斯特菌XFL0605株LIPI-1编码的6个毒力基因核苷酸序列进行分析表明,各毒力基因反映出来的进化关系不尽一致,表明该菌株在获得LIPI-1外源性毒力基因方面具有不同步性,各毒力基因的来源也不尽相同。对XFL0605菌株中LIPI-1各毒力基因所推导氨基酸序列N端作信号肽预测分析结果表明,PlcA、LLO、Mpl、ActA和PlcB5个毒力蛋白中均存在信号肽序列;actA基因推导氨基酸序列中存在跨膜区（578-600位编码氨基酸）,其跨膜蛋白为Ⅰ型。LIPI-1序列中存在5个14bp的PrfA蛋白结合区,分别位于plcA上游59-73bp处,prfA上游62-75bp处,hlyA基因的上游183-196bp处,mpl上游185-198bp和actA基因上游185-198bp处。这些核苷酸序列是调控蛋白PrfA的结合位点,并具有回文结构的特点。对3个菌株CXFL0605、C53004和CCTCCAB97021)hlyA基因和推导氨基酸序列进行了分析,发现三者具有高度同源性,hly基因同源性在96.9%——100%之间,氨基酸同源性在97.9%以上,并具有相同的PEST基序和C端保守11肽序列,表明所测定3个菌株培养上清中LLO活性基本相当具有遗传基础。对克隆的hlyA基因所推导溶血素氨基酸序列进行PEST分析结果表明,编码LLO的N端32-50位氨基酸序列（KENSISSMAPPASPPASPK）为富含P（脯氨酸）、E（谷氨酸）、S（丝氨酸）和T（苏氨酸）的PEST（Pro-Glu-Ser-Thr）基序,PEST find值为4.71。试验菌株XFL0605actA基因编码604个氨基酸,缺失了105bp富脯氨酸重复片段编码碱基,只有两个E/DFPPPPXD/E重复序列。本研究中发现3株单核细胞增多性李斯特菌溶血素中PEST基序的氨基酸序列完全相同,而且存在PPAS氨基酸重复序列。3个菌株LLO氨基酸序列的C端483-493位存在相同的保守11个氨基酸多肽（序列为ECTGLAWEWWR）,该11肽保守序列是CDTX类毒素的特征性序列。

论文目录

  • 目录
  • 中文摘要
  • Abstract
  • 缩略词表
  • 第1章:文献综述
  • 1.1 单核细胞增多性李斯特菌感染的公共卫生学意义
  • 1.2 单核细胞增多性李斯特菌感染与防治
  • 1.2.1 生物学分类
  • 1.2.2 生物学特性
  • 1.2.2.1 形态与染色特性
  • 1.2.2.2 培养特性
  • 1.2.2.3 生化特性
  • 1.2.2.4 抵抗力
  • 1.2.2.5 血清型及分型
  • 1.2.2.6 致病性
  • 1.2.3 流行病学
  • 1.2.4 临床症状
  • 1.2.5 致病机理
  • 1.2.6 诊断与检测技术进展
  • 1.2.6.1 分离培养鉴定
  • 1.2.6.2 免疫学检测技术
  • 1.2.6.3 分子生物学检测技术
  • 1.2.7 防治
  • 1.3 单核细胞增多性李斯特菌分子生物学研究
  • 1.3.1 分子流行病学
  • 1.3.2 主要的毒力因子
  • 1.3.2.1 溶血素
  • 1.3.2.2 磷脂酶C
  • 1.3.2.3 胞外蛋白ActA
  • 1.3.2.4 金属蛋白酶Mpl
  • 1.3.2.5 PrfA转录激活调节蛋白基因
  • 1.3.2.6 内化素
  • 1.3.2.7 P60
  • 1.3.2.8 培养条件对毒力因子表达的影响
  • 1.3.3 单核细胞增多性李斯特菌毒力岛研究
  • 1.3.3.1 LIPI-1
  • 1.3.3.2 LIPI-2
  • 1.3.4 单核细胞增多性李斯特菌在疫苗研制中的应用
  • 1.5 展望
  • 第2章:研究目的与意义
  • 第3章:单核细胞增多性李斯特菌分离鉴定与生物学特性研究
  • 3.1 材料
  • 3.1.1 实验样品
  • 3.1.2 实验菌株
  • 3.1.3 培养基与实验动物
  • 3.1.4 主要试剂与溶液的配制
  • 3.1.5 主要设备
  • 3.2 方法
  • 3.2.1 菌株的分离培养
  • 3.2.2 革兰氏染色镜检
  • 3.2.3 分离菌株生化鉴定
  • 3.2.4 计数试验
  • 3.2.5 小鼠毒力测定
  • 3.2.6 药敏试验
  • 3.2.7 平板溶血试验
  • 3.2.8 溶血活性测定
  • 3.2.8.1 微量反应板梯度稀释法
  • 3.2.8.2 紫外分光光度法
  • 3.3 结果与分析
  • 3.3.1 单核细胞增多性李斯特菌分离鉴定
  • 3.3.1.1 分离鉴定结果
  • 3.3.1.2 菌落特征与形态
  • 3.3.1.3 生化鉴定
  • 3.3.1.4 平板溶血试验
  • 3.3.2 药敏试验
  • 3.3.3 小鼠毒力试验
  • 3.3.4 溶血素活性测定
  • 3.3.4.1 微量反应板梯度稀释法
  • 3.3.4.2 分光光度法检测LM溶血素活性
  • 3.4 讨论
  • 3.4.1 分离鉴定和培养基的改良
  • 3.4.2 溶血素活性及影响因素
  • 3.4.3 溶血活性测定
  • 3.4.4 冷冻食品中的LM污染
  • 3.5 小结
  • 第4章 单核细胞增多性李斯特菌PCR和PCR-ELISA检测方法研究
  • 4.1 实验材料
  • 4.1.1 质粒与菌株
  • 4.1.2 引物与探针
  • 4.1.3 主要培养基
  • 4.1.4 酶与试剂
  • 4.1.5 主要试剂配制
  • 4.1.6 试验仪器与器材
  • 4.2 试验方法
  • 4.2.1 样品的处理与菌株分离鉴定
  • 4.2.2 DNA模板的制备
  • 4.2.3 PCR反应与检测
  • 4.2.3.1 PCR反应体系与条件
  • 4.2.3.2 PCR扩增产物的电泳检测
  • 4.2.3.3 PCR产物测序鉴定
  • 4.2.4 微孔板包被
  • 4.2.5 扩增产物微孔板杂交检测
  • 4.2.5.1 变性反应条件优化
  • 4.2.5.2 杂交探针的浓度选择
  • 4.2.5.3 杂交条件选择
  • 4.2.5.4 显色条件优化
  • 4.2.6 特异性试验
  • 4.2.7 敏感性试验
  • 4.2.8 重复性试验
  • 4.2.9 样品检测
  • 4.3 结果与分析
  • 4.3.1 hlyA基因PCR检测结果
  • 4.3.1.1 hlyA基因PCR电泳检测结果
  • 4.3.1.2 hlyA基因PCR产物测序结果
  • 4.3.2 hlyA基因PCR-ELISA检测方法的建立
  • 4.3.2.1 包被与封闭条件的选择
  • 4.3.2.2 变性条件选择
  • 4.3.2.3 杂交条件选择
  • 4.3.2.4 化学变性与热变性杂交反应结果比较
  • 4.4.2.5 酶促显色条件选择
  • 4.4.2.6 PCR产物浓度选择
  • 4.3.3 PCR与PCR-ELISA方法敏感性试验
  • 4.3.4 特异性试验
  • 4.3.5 重复性试验
  • 4.3.6 样品检测结果
  • 4.4 讨论
  • 4.4.1 关于靶基因的选择
  • 4.4.2 PCR-ELISA方法与体系优化
  • 4.4.3 方法敏感性与特异性
  • 4.5 小结
  • 第5章:单核细胞增多性李斯特菌LIPI-1全基因克隆与序列分析
  • 5.1 材料
  • 5.1.1 菌种与质粒
  • 5.1.2 主要培养基
  • 5.1.3 主要药品及试剂盒
  • 5.1.4 引物
  • 5.1.5 主要试剂的配制
  • 5.1.6 主要仪器设备
  • 5.2 试验方法
  • 5.2.1 细菌基因组DNA的提取
  • 5.2.2 基因分段扩增
  • 5.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
  • 5.2.4 PCR产物的T克隆载体构建
  • 5.2.4.1 加A尾反应
  • 5.2.4.2 连接反应
  • 5.2.5 连接产物的转化筛选
  • 5.2.6 质粒的小量制备（碱裂解法）
  • 5.2.7 重组质粒的酶切鉴定
  • 5.2.8 酶切产物的回收与纯化
  • 5.2.9 序列测定与分析
  • 5.3 结果与分析
  • 5.3.1 各基因片段PCR扩增
  • 5.3.2 PCR扩增片段与pTA2载体的连接、转化与鉴定
  • 5.3.3 LIPI-1各基因克隆片段的序列测定
  • 5.3.4 LIPI-1各毒力基因序列分析
  • 5.3.4.1 prfA
  • 5.3.4.2 picA
  • 5.3.4.3 hlyA
  • 5.3.4.4 mpl
  • 5.3.4.5 actA
  • 5.3.4.6 plcB
  • 5.3.4.7 LIPI-1全基因序列分析
  • 5.3.4.8 PrfA蛋白结合区分析
  • 5.3.5 LIPI-1基因编码毒力蛋白的特征分析
  • 5.3.5.1 各毒力基因编码蛋白的信号肽预测
  • 5.3.5.2 各毒力基因编码蛋白的跨膜区预测
  • 5.3.5.3 各毒力基因编码蛋白的其它结构特点
  • 5.4 讨论
  • 5.5 小结
  • 第6章:结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录1 LM菌株XFL0605 LIPI-1毒力岛全基因序列
  • 附录2 LM菌株XFL0605 LIPI-1基因推导氨基酸序列
  • 附录3 个人资料

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