论文摘要
人信号素基因semaphorins是神经导向因子家族中非常重要的成员,众多研究表明它在神经轴突的延伸、血管内皮细胞生长和迁移过程中都发挥着重要的导向作用。Semaphorin-3F（SEMA-3F）是其家族3亚族成员之一,是家族中最具代表性的、研究最透彻的分泌型蛋白之一,存在于许多细胞和组织中。近年来学者发现SEMA-3F属于抑癌基因,其在小细胞肺癌、恶性黑色素瘤、头颈肿瘤等众多肿瘤组织细胞中表达下调或缺失,对于各种恶性细胞的增殖具有强烈的抑制作用。由此提示,SEMA-3F基因在舌鳞癌中可能同样表达下调,抑制舌癌细胞的增殖。本实验应用阳离子脂质体转染法将外源性SEMA-3F基因导入Tca8113舌鳞癌细胞中,筛选相对稳定表达的克隆株细胞并鉴定,使用甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法、流式细胞仪（flow cytometer,FCM）等方法检测SEMA-3F基因转染对Tca8113舌鳞癌细胞增殖情况的影响,并对结果进行探讨。方法:实验设转染组、空载体组、未转染组及对照组（仅加转染试剂）。应用阳离子脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将外源性SEMA-3F基因导入Tea8113舌鳞癌细胞中。转染后48h,加入400μg/mL浓度的遗传霉素（G418）进行抗性筛选培养,每隔3～5d换液一次,维持抗性筛选4周,获得相对稳定表达的克隆株细胞。通过逆转录PCR（RT-PCR）、蛋白质印迹法（Western Blotting）等方法鉴定外源基因在细胞中的表达,使用甲基噻唑基四唑（MTT）法、流式细胞仪（FCM）等方法检测SEMA-3F基因转染对Tca8113舌鳞癌细胞增殖情况的影响。结果:转染组细胞经G418抗性筛选2周之后,出现产生抗性的克隆团;暗室中倒置荧光显微镜下观察,部分细胞带有绿色荧光标记。RT-PCR、Western Blotting等方法检测发现未转染组细胞SEMA-3F表达很弱,而转染组基因获得高表达。MTT法检测瞬时转染后24、48、72、96h以及G418抗性筛选4周后24、48、72、96h,结果发现SEMA-3F转染组细胞吸光度值（OD值）均低于其余各组。流式细胞仪检测结果:SEMA-3F基因转染使G1期细胞比例降低,S期比例增高,推测其主要作用于G1期和S期。结论:人信号素基因semaphorin-3F在Tca8113舌鳞癌细胞中表达很弱,几乎检测不到。通过阳离子脂质体转染的方法,Tca8113舌鳞癌细胞中能够稳定表达外源性SEMA-3F。SEMA-3F对于舌鳞癌细胞的增殖具有强烈的抑制作用。推测SEMA-3F通过干扰舌癌细胞的细胞周期,完成对舌癌细胞的增殖抑制作用。