禾谷丝核菌拮抗细菌RB5的分离鉴定及其抑菌活性研究

论文摘要

禾谷丝核菌侵染引起的小麦纹枯病极大的影响了小麦的产量。随着化学农药的大量使用，土地盐碱化以及环境的破坏已日趋严重，开发出既能防治病虫害，又不污染破坏环境的药物已迫在眉睫，土壤中含有大量的有益微生物，其代谢产物能有效防治病虫害并促进植物生长。本研究从小麦根际土壤中，筛选对禾谷丝核菌有较高拮抗作用的菌株，并对其进行了种属鉴定和抑菌活性研究，为小麦纹枯病的有效防治和生防杀菌剂的开发奠定了基础。从小麦根际土壤中共分离纯化了158株细菌，经平板对峙实验反复筛选后发现有7株细菌抑菌效果较好。其中RB5的抑菌能力最强，抑制率高达78.6%。发酵液的抑菌活性达58.2%。根据形态学特征、生理生化特性测定和16S rDNA序列分析将拮抗细菌RB5鉴定为荧光假单胞菌（Pseudomonas sp.）。通过显微镜观察经拮抗菌发酵液处理过的禾谷丝核菌菌丝，发现菌丝发生明显的弯曲和断裂。测定经发酵液处理过的菌丝产生的三种胞壁降解酶的活性，其活性都较对照组显著下降。当RB5发酵液浓度为100%时对多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)和果胶甲基反式消除酶(PMTE)三种酶的活性抑制率最大，分别为87.83%、97.98%和94.68%。为提高拮抗细菌RB5发酵产物的抑菌活性，进行了C源和N源的单因素条件优化，实验结果表明，甘油作为C源，酵母膏作为N源有很高的抑菌效果。为降低实验生产成本且保证RB5菌株的的生防作用，使用价格较低且营养成分较高豆粕作为N源，木薯作为C源作为培养基主要成分，设计PB实验，从七因素中找出了影响实验的显著因素，分别为C源，N源和转速。以上述三个因素设计响应面实验，实验后抑菌效果最好达到82%。通过方差分析，计算出最优试验条件为C源87%、N源52%、转速218r/min。通过验证得出抑制率平均值为79.06%，与理论值相差8％。表明此条件合理且效果明显。为明确拮抗细菌RB5发酵液的活性成分，进行了嗜铁素、蛋白酶、几丁质酶等代谢产物的检测，检测结果都为阳性，证明发酵液中含有这些代谢产物。同时进行了一些代谢物质的分子方法检测，结果发现RB5含有与吡咯菌素（PRN）的产生相关基因Prnd。为进一步验证RB5菌株处理发酵液的实际效用，进行了室内防效盆栽实验，室内防效最高达到了36%。证明了RB5有很好的抵抗禾谷丝核菌的能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 小麦纹枯病
• 1.2 小麦纹枯病的病原菌研究
• 1.3 小麦纹枯病的防治技术
• 1.4 病原菌的微生物防治
• 1.5 生防细菌及其作用机制
• 1.6 禾谷丝核菌拮抗菌的研究进展
• 1.7 荧光假单胞菌的研究现状
• 1.8 研究目的及意义
• 1.9 主要研究内容和技术路线
• 第二章 拮抗细菌的筛选和鉴定
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 病原菌
• 2.1.2 土样
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.1.5 试剂和仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 土样的采集
• 2.2.2 病原菌的培养
• 2.2.3 拮抗细菌的初筛
• 2.2.4 生防细菌的复筛
• 2.2.5 生防细菌的生理生化特性鉴定
• 2.2.6 细菌基因组的提取
• 2.2.7 16SrDNA 序列的 PCR 扩增
• 2.2.8 目的片段回收
• 2.2.9 感受态细胞的制备
• 2.2.10 连接
• 2.2.11 转化
• 2.2.12 菌落 PCR
• 2.2.13 基因测序与分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 土壤中细菌的分离纯化
• 2.3.2 土壤中细菌的初筛
• 2.3.3 拮抗细菌的复筛
• 2.3.4 拮抗细菌 RB5 的形态特征
• 2.3.5 拮抗细菌 RB5 的生理生化特性
• 2.3.6 16Sr DNA 序列扩增
• 2.3.7 系统发育树构建
• 2.4 讨论
• 第三章 拮抗细菌 RB5 的抗菌机理研究
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 拮抗细菌
• 3.1.2 病原菌
• 3.1.3 仪器和试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.1.5 溶液配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 菌种活化及保藏
• 3.2.2 拮抗细菌发酵液的获得
• 3.2.3 禾谷丝核菌菌碟的获得
• 3.2.4 拮抗细菌发酵液对禾谷丝核菌抑菌能力测定
• 3.2.5 发酵液对禾谷丝核菌结构的影响研究
• 3.2.6 禾谷丝核菌细胞壁降解酶活性测定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 拮抗细菌发酵液对禾谷丝核菌菌丝生长抑制作用
• 3.3.2 发酵液对禾谷丝核菌结构的影响
• 3.3.3 蛋白质和还原糖标准曲线
• 3.3.4 拮抗细菌发酵液对禾谷丝核菌细胞壁降解酶活性的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 拮抗细菌 RB5 发酵条件的响应面法优化
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 拮抗菌株
• 4.1.2 病原菌
• 4.1.3 培养基
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 菌种活化及保藏
• 4.2.2 单因素优化
• 4.2.3 PB 试验设计
• 4.2.4 最陡爬坡实验
• 4.2.5 响应面实验设计
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 C 源优化结果
• 4.3.2 N 源优化结果
• 4.3.4 发酵原料筛选结果
• 4.3.5 PB 试验结果
• 4.3.6 最陡爬坡实验结果与分析
• 4.3.7 响应面优化实验结果与分析
• 4.3.8 培养基最适组合
• 4.3.9 模型的验证
• 4.4 讨论
• 第五章 生防菌株 RB5 活性物质初步研究
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 供试菌株
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 缓冲液配置
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 菌种活化及保藏
• 5.2.2 发酵液样品的制备
• 5.2.8 荧光色素的检验
• 5.2.9 嗜铁素检测试验
• 5.2.10 几种代谢产物的检测
• 5.2.11 嗜铁素目的基因引物的设计
• 5.2.12 拮抗物质的分子检测
• 5.2.13 几丁质酶的提取与分离
• 5.2.14 高效液相检测试验
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 荧光素检测实验结果
• 5.3.2 嗜铁素验证结果
• 5.3.3 嗜铁素目的基因
• 5.3.4 分子检测代谢物质结果
• 5.3.5 蛋白酶检测
• 5.3.6 几丁质酶检测
• 5.3.7 几丁质酶的提纯
• 5.3.8 高效液相实验对比检测结果
• 5.4 讨论
• 第六章 发酵液的室内盆栽防效研究
• 6.1 试验材料
• 6.1.1 供试小麦
• 6.1.2 病原菌
• 6.1.3 发酵液
• 6.2 试验方法
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 处理小麦的发病情况
• 6.3.2 室内盆栽防效结果
• 6.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历