骨唾液酸蛋白在乳腺癌骨转移中作用的研究

论文题目: 骨唾液酸蛋白在乳腺癌骨转移中作用的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 发酵工程

作者: 杜红延

导师: 郭勇,王捷

关键词: 骨唾液酸蛋白,乳腺癌,骨转移,体内外作用

文献来源: 华南理工大学

发表年度: 2005

论文摘要: 乳腺癌是目前严重威胁女性健康的一类恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤发病率的第一位。然而许多乳腺癌患者并不是直接死于原发乳腺肿瘤，而是死于肿瘤其他部位的扩散转移。其中骨是乳腺癌转移最常见的靶器官之一。深入研究肿瘤骨转移的分子和细胞学机制，可以更好的指导乳腺癌骨转移相关疾病的临床诊断和治疗。骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein，简称BSP)是细胞外基质中的一种高度糖基化和磷酸化的酸性糖蛋白，富含唾液酸。其组织分布具有局限性，分布在矿化组织，包括骨、牙齿和钙化的软骨等，主要由成骨细胞、破骨细胞以及软骨细胞表达和分泌，参与组织矿化，与多种骨代谢性疾病有关，而近年来的研究又发现BSP与乳腺癌的骨转移密切相关。因而深入研究BSP在乳腺癌骨转移中的作用，揭示其作用机制，有可能为乳腺癌骨转移的预防和治疗提供新的药物靶点。构建hBSP稳定高表达系统是研究hBSP在乳腺癌骨转移中作用的关键，本文通过构建hBSP的真核表达载体，并转染乳腺癌细胞，进行BSP促进乳腺癌骨转移的体内外试验研究。首先构建hBSP与绿色荧光蛋白(GFP)非融合表达的分泌型真核表达载体pIRES2-hBSP-EGFP和膜靶向定位真核表达载体pID-hBSP-EGFP。从pB-hBSP中PCR亚克隆扩增带有分泌信号肽的hbsp基因片段，插入非融合表达的真核表达载体pIRES2-EGFP中，获得重组表达载体pIRES2-hBSP-EGFP，该载体插入hbsp基因片段带有分泌信号肽可以将表达的蛋白分泌至细胞外。同时将不带信号肽的hbsp基因片段插入膜靶向表达载体pDisplay中，构建真核表达载体pDisplay-hBSP，再以该载体为模板PCR扩增膜靶向定位信号肽、hBSP以及膜靶向定位蛋白基因片段，并插入pIRES2-EGFP中，获得重组表达载体pID-hBSP-EGFP，该载体可将hBSP蛋白表达定位于细胞膜。将pIRES2-hBSP-EGFP和pID-hBSP-EGFP利用脂质体介导分别转染发生特异性骨转移和脑转移的乳腺癌细胞。经过转染条件的优化，最终确定96孔培养板中细胞融合度达到90％，用1μg脂质体介导280ng重组质粒转染10h可获得较满意的转染效率，最高可达19.70±1.10％。由G418对乳腺癌细胞杀伤曲线试验确定稳定转染细胞G418的筛选浓度为400μg／ml，G418抗性筛选和流式细胞仪荧光分选获得稳定转染pIRES2-hBSP-EGFP和pID-hBSP-EGFP重组表达载体的特异性骨转移乳腺癌细胞MDA-MB-231BO(pI)和MDA-MB-231BO(pID)。细胞免疫组化结果表明乳腺癌细胞MDA-MB-231BO(pI)和

论文目录:

摘要

ABSTRCT

英文缩略词表

第一章绪论

1.1 乳腺癌骨转移的研究进展

1.1.1 乳腺癌骨转移的途径和方式

1.1.2 乳腺癌骨转移的分子和细胞学机制

1.1.3 乳腺癌骨转移模型的研究

1.1.4 治疗现状

1.2 骨唾液酸蛋白的研究现状

1.2.1 骨唾液酸蛋白的结构与理化性质

1.2.2 骨唾液酸蛋白与肿瘤骨转移的研究进展

1.3 本课题的研究背景及研究意义

1.4 本课题的主要研究内容

1.4.1 骨唾液蛋白基因的亚克隆及真核表达载体的构建

1.4.2 稳定表达BSP的乳腺癌细胞株的建立和鉴定

1.4.3 稳定转染乳腺癌细胞生物学性质的研究

1.4.4 BSP在乳腺癌骨转移中作用的体内研究

第二章 pIRES2-hBSP-EGFP和pID-hBSP-EGFP真核表达载体的构建及在人乳腺癌细胞MDA-MB-231BR和MDA-MB-231BO中的表达

2.1 引言

2.2 实验材料

2.2.1 质粒、菌株和细胞

2.2.2 主要试剂

2.2.3 培养基和溶液

2.2.4 主要仪器设备

2.3 技术路线

2.4 实验方法

2.4.1 重组质粒pIRES2-hBSP-EGFP和pDisplay-hBSP的构建

2.4.2 pID-hBSP-EGFP载体的构建

2.4.3 乳腺癌细胞的培养

2.4.4 乳腺癌细胞的转染

2.5 结果与讨论

2.5.1 pIRES2-hBSP-EGFP载体的构建

2.5.2 pID-hBSP-EGFP载体的构建

2.5.3 细胞转染结果

2.6 小结

第三章乳腺癌细胞转染条件的优化及稳定转染乳腺癌细胞的筛选和鉴定

3.1 引言

3.2 试验材料

3.2.1 质粒、菌株和细胞

3.2.2 主要试剂

3.2.3 培养基和溶液

3.2.4 主要仪器设备

3.3 技术路线

3.4 实验方法

3.4.1 乳腺癌细胞转染条件的优化

3.4.2 稳定转染细胞的筛选

3.4.3 hBSP表达的检测

3.4.4 统计方法

3.5 结果与讨论

3.5.1 乳腺癌细胞转染条件的优化

3.5.2 稳定转染乳腺癌细胞的筛选

3.5.3 免疫组化检测hBSP的表达

3.5.4 基因组DNA neo基因扩增结果

3.5.5 SDS-PAGE和Western-bloting检测hBSP表达情况

3.5.6 ELISA检测细胞培养上清hBSP表达情况

3.5.7 半定量RT-PCR检测细胞中hBSP mRNA表达情况

3.6 小结

第四章 BSP的表达对乳腺癌细胞生物学性质的影响

4.1 前言

4.2 实验材料

4.2.1 细胞和鸡胚

4.2.2 主要试剂

4.2.3 溶液

4.2.4 主要仪器设备

4.3 技术路线

4.4 实验方法

4.4.1 乳腺癌细胞生长曲线测定方法

4.4.2 双层琼脂法测定乳腺癌细胞克隆形成率

4.4.3 乳腺癌细胞粘附试验

4.4.4 鸡胚尿囊绒膜试验测定乳腺癌细胞血管侵袭能力

4.4.5 乳腺癌细胞骨条吸附试验

4.4.6 统计方法

4.5 结果与讨论

4.5.1 BSP的表达对乳腺癌细胞生长特性的影响

4.5.2 BSP的表达对乳腺癌细胞克隆形成活性的影响

4.5.3 BSP的表达对乳腺癌细胞粘附特性的影响

4.5.4 BSP的表达对乳腺癌细胞血管侵袭能力的影响

4.5.5 BSP的表达对乳腺癌细胞骨条吸附能力的影响

4.6 小结

第五章 BSP在乳腺癌骨转移中作用的体内初步研究

5.1 前言

5.2 实验材料

5.2.1 细胞和动物

5.2.2 主要试剂

5.2.3 溶液

5.2.4 主要仪器设备

5.3 技术路线

5.4 实验方法

5.4.1 裸鼠的饲养

5.4.2 乳腺癌细胞的裸鼠左心室注射

5.4.3 X光片的拍摄

5.4.4 组织学检查

5.4.5 统计方法

5.5 结果与讨论

5.5.1 裸鼠的体重变化

5.5.2 裸鼠骨组织x光片检查

5.5.3 裸鼠中器官发生转移的几率

5.5.4 脑组织HE染色结果

5.5.5 肺组织HE染色结果

5.5.6 骨组织HE染色结果

5.5.7 骨组织免疫组化结果

5.6 小结

结论与展望

参考文献

攻读学位期间发表论文

致谢

附录

发布时间: 2006-09-19

参考文献

[1].乳腺癌maspin、BCSG1表达情况及新辅助化疗对其表达影响的研究[D]. 刘巍.河北医科大学2005
[2].乳腺癌骨转移早期事件的探讨[D]. 张会来.天津医科大学2006
[3].VEGF-C、FLT-4和nm23在人类乳腺癌中的表达及意义[D]. 孙百顺.中国协和医科大学2006
[4].抗骨桥蛋白抗体治疗乳腺癌骨转移的实验研究[D]. 何英.中南大学2007
[5].乳腺癌原位和骨转移靶向载体研究[D]. 董坚.昆明医学院2008
[6].非酒精性脂肪肝降低乳腺癌患者肝转移率的临床研究[D]. 吴文郁.南方医科大学2018
[7].黄芩苷抑制三阴性乳腺癌侵袭和上皮间质转化的作用及相关机理研究[D]. 陈州华.湖南中医药大学2018
[8].FLI-1在乳腺癌中的生物学功能及分子机制研究[D]. 闫旭.吉林大学2018
[9].活性维生素D经Bmi-1介导在抑制乳腺癌移植瘤生长和骨转移中的作用和机制研究[D]. 鲁光平.南京医科大学2018
[10].乳腺癌显像药物99mTc-AF7P动物显像和99mTc-3PRGD2临床应用的研究[D]. 闵楷茵.吉林大学2017

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