铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa PCC 7820基因组文库构建、mazEF基因克隆及其功能的初步研究

论文摘要

铜绿微囊藻是形成富营养化危害的主要藻类,其分布的面积很广,随着近年来水华的频发,成为了研究的焦点。毒素与抗毒素系统,简称TA系统,任一TA系统基本上含有毒素基因和抗毒素基因,而抗毒素基因的作用就在于干扰毒素基因的功能。当不稳定的抗毒蛋白迅速降解时,降解速度较慢的毒蛋白对细胞体进行自我攻击,选择性死亡。这个过程受到压力条件的诱导。而TA系统又与细菌的细胞程序性死亡（PCD）相联系,细菌群体选择性的部分的消亡以换得群体的生存。通过构建铜绿微囊藻PCC7820基因组文库,获得了4个与TA系统相关的基因,从中选择MazF基因展开进一步的研究。首先,为了更好地研究MazEF复合体蛋白,采用反向PCR的方法,对mazF侧翼进行扩增,获得了mazE及mazEF启动子核苷酸序列,证实了铜绿微囊藻mazEF的基因结构,并用生物信息学的方法预测了启动子相关元件,推断其可能为诱导型启动子,而藻类的MazF在系统进化上是独树一帜的,这可能与蓝藻作为光合自养生物所特有的生理属性相关。而后对铜绿微囊藻的MazE、MazF、MazEF进行了重组表达质粒的构建,当将质粒pET-His-MazF转化到表达菌株时,MazF的本底表达抑制了细胞生长,由此说明其具有较大的毒性,而MazE的共表达有效地解除了这种毒性。通过PCR的方法随机突变mazF,使得MazF的功能发生了变化,对细胞的抑制作用消失,这说明这些突变的碱基对MazF的功能都具有影响。其次,通过pull-down等方法在体外证实了MazE和MazF蛋白的相互作用。然后以GST-MazF为诱饵,通过pull-down从铜绿微囊藻PCC7820筛选到五个与MazF相互作用的蛋白,这五个蛋白的功能在一定程度上说明了MazF在细胞程序死亡路径中作为仲裁者而非执行者的作用。与此同时,以GST-MazE为诱饵,通过pull-down使铜绿微囊藻PCC7820蛋白与GST-MazE相互作用,实验结果说明铜绿微囊藻中存在着某种特有蛋白质具有降解其自身MazE的作用,不管MazE处于游离状态或者与MazF结合状态,而大肠杆菌中缺乏该种蛋白或辅助因子,同时这种蛋白的表达对MazE的影响具有时效性。最后,将His6-MazE、GST-MazF融合蛋白经纯化后作为抗原免疫小鼠制备了多克隆抗体,利用多克隆抗体对铜绿微囊藻中MazE、MazF蛋白在逆境下表达量的变化进行了检测,获得了初步结果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 铜绿微囊藻与水华
• 2 毒素与抗毒素系统
• 3 全基因组鸟枪测序法
• 4 基因克隆及反向PCR
• 5 蛋白质相互作用研究方法概述
• 材料和方法
• 1 材料
• 2 实验方法
• 结果和分析
• 1 铜绿微囊藻基因组文库的构建及随机测序
• 2 铜绿微囊藻PCC7820mazEF基因的获取
• 3 MazEF功能的研究
• 讨论
• 1 铜绿微囊藻基因组文库构建及鸟枪法随机测序有效获得基因信息
• 2 蛋白表达
• 3 MazF的毒性作用
• 4 启动子问题
• 5 MazE、MazF和蛋白酶
• 6 MazF相互作用的蛋白质
• 小结与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢