杏鲍茹中SOD的分离纯化、脂质体制备及其抑制肿瘤细胞活性研究

论文摘要

在细胞的氧化代谢过程中,不断产生各种活性氧。在细胞处于正常状态时,细胞内的抗氧化系统起着清除自由基的作用,使细胞处于一个氧化平衡状态。但当机体处于衰老、氧化应激或某些病理情况下时,活性氧产生增多或机体清除能力减弱,过量的活性氧对组织细胞的化学结构发生破坏性修饰,损伤正常组织细胞的形态和功能。SOD是生物体防御活性氧毒害的关键性防线。研究表明,SOD与癌症等多种疾病之间有着极其密切的关系。本课题以杏鲍菇为原材料,通过超声波破碎、硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法分离纯化了SOD,并通过UV、MALDI-TOF-TOF MS、ICP-MS、SDS-PAGE、HPLC等分析方法对该SOD的类型及纯度进行了鉴定。此外,通过单因素考察和正交实验的方法优化了SOD脂质体的制备工艺,并研究了所制得SOD脂质体的生物学功能。本课题以杏鲍菇子实体为原料,分离纯化得到了液相纯的SOD,活性为3900U/mg,纯化倍数为177倍,回收率为13.0%。在提取过程中对超声破碎功率、破碎时间、层析顺序等因素进行了优化,最终选择的超声功率是160W,超声时间为9min。MALDI-TOF-TOF质谱仪测定结果显示,该SOD分子量为31503,亚基分子量为15790；ICP-MS显示该SOD含铜和锌而不含锰；紫外光谱显示该SOD在258nm处具有最大吸收；活性抑制实验结果显示该SOD对双氧水和叠氮钠敏感,而对SDS不敏感；这些证据均证明该SOD为Cu/Zn-SOD。本文以脂质体的包封率及粒径为评价指标,在单因素考察磷脂与胆固醇比例、超声时间、水相pH值及水相体积对制备脂质体包封率影响的基础上,利用正交设计方法对SOD脂质体的制备工艺进行了优化。最终确定SOD脂质体的制备条件为PC：CH=1：1,pH值为8.2,超声时间为8min,水相体积为3mL。稳定性实验结果表明,所制备的SOD脂质体在2个月内渗漏率小于20%。本文以制备得到的SOD脂质体作为药物,并以未包封SOD作为对照,研究了SOD脂质体抑制肝癌细胞生长的能力。结果显示,SOD脂质体能很好地抑制肝癌细胞hepG2和肝正常细胞L02生长,而未包封SOD则未显示出任何抑制作用。将白藜芦醇制成脂质体后,则发现包封前与包封后白藜芦醇抑制细胞生长作用的变化不大。对SOD脂质体作用后细胞内SOD活性及ROS含量的测定结果表明,加入SOD脂质体后,细胞内SOD活性增加,ROS含量减少。说明SOD抑制肝癌细胞生长的机理可能是SOD进入细胞并清除了细胞内的ROS,导致了细胞的凋亡,而未包封SOD因不能进入细胞而未能抑制肿瘤细胞生长。本文的研究结果表明,杏鲍菇作为一种珍稀食药用菌,其子实体中提取的SOD经制备成脂质体后可明显抑制肿瘤细胞生长,对其进行进一步改进后将会有广阔的应用前景。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 本论文中所使用的符号与缩略词对照表
• 第一章 绪论
• 第一节 综述
• 1 活性氧对机体的作用
• 1.1 活性氧的产生途径
• 1.2 活性氧的危害
• 2 SOD的来源及分类
• 2.1 SOD的来源
• 2.2 SOD的分类
• 3 SOD的结构和性质
• 3.1 空间结构
• 3.2 SOD的性质
• 4 SOD模拟与修饰
• 4.1 SOD脂质体
• 4.2 SOD模拟物
• 4.3 SOD化学修饰
• 5 SOD的应用前景
• 5.1 抗衰老作用
• 5.2 辐射病及辐射防护
• 5.3 治疗心脑血管疾病
• 5.4 治疗炎症
• 5.5 保护男性生殖健康
• 5.6 治疗糖尿病
• 5.7 治疗癌症及防止化疗损伤
• 第二节 课题依据与研究内容
• 1 课题依据
• 2 课题内容
• 3 课题意义
• 参考文献
• 第二章 杏鲍菇中SOD的分离纯化、类型鉴定及稳定性研究
• 第一节 杏鲍菇中SOD的提取分离
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器及材料
• 1.2 主要试剂及药品
• 2 实验方法
• 2.1 杏鲍菇中SOD的超声提取
• 2.2 杏鲍菇中SOD的分离
• 2.3 SOD活性的测定
• 2.4 蛋白含量的测定
• 3 结果
• 3.1 超声功率优化
• 3.2 超声时间优化
• 3.3 SOD提取分离
• 第二节 SOD的纯化及鉴定
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器及材料
• 1.2 主要试剂及药品
• 2 实验方法
• 2.1 DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析
• 2.2 Sephacryl S-100凝胶过滤层析
• 2.3 SDS-PAGE测SOD纯度
• 2.4 HPLC测定SOD纯度
• 2.5 SOD的紫外光谱
• 2.6 SOD的分子量测定
• 2.7 SOD所含金属元素的测定
• 2.8 化学试剂对SOD活性的抑制性作用
• 3 结果
• 3.1 SOD的离子交换层析
• 3.2 SOD的凝胶过滤层析
• 3.3 SOD的分离纯化
• 3.4 SDS-PAGE鉴定SOD纯度
• 3.5 SOD的紫外光谱扫描
• 3.6 HPLC鉴定SOD纯度
• 3.7 SOD的分子量测定
• 3.8 SOD的金属含量测定
• 3.9 化学试剂对SOD活性的抑制性作用
• 第三节 SOD的稳定性研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器及材料
• 1.2 主要试剂及药品
• 2 实验方法
• 2.1 SOD的pH稳定性测定
• 2.2 SOD的热稳定性测定
• 3 结果
• 3.1 SOD的pH稳定性测定结果
• 3.2 SOD的热稳定性测定结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第三章 SOD纳米脂质体的制备
• 1 仪器及试剂
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要试剂
• 2 实验方法
• 2.1 不同制备方法的筛选
• 2.2 大豆卵磷脂与胆固醇质量比优化
• 2.3 超声时间优化
• 2.4 pH值条件优化
• 2.5 水相体积优化
• 2.6 脂质体工艺正交实验优化
• 2.7 SOD脂质体的稳定性考察
• 2.8 包封率的测定方法
• 2.9 粒径的测定方法
• 2.10 SOD脂质体的粒径测定
• 3 结果
• 3.1 制备方法对包封率及粒径的影响
• 3.2 磷脂/胆固醇比例对包封率的影响
• 3.3 超声时间对包封率的影响
• 3.4 pH值对包封率的影响
• 3.5 水相体积对包封率的影响
• 3.6 正交实验
• 3.7 SOD脂质体的稳定性实验
• 4 讨论
• 5 小结
• 第四章 SOD纳米脂质体的抑制肿瘤细胞活性研究
• 1 仪器及材料
• 1.1 主要仪器
• 1.2 主要材料
• 2 实验方法
• 2.1 SOD及白藜芦醇的抗氧化能力测定
• 2.2 脂质体的制备
• 2.3 脂质体包封率的测定
• 2.4 SOD脂质体对肿瘤细胞及正常细胞的作用研究
• 2.5 SOD脂质体作用后细胞内SOD活性测定
• 2.6 SOD脂质体作用后细胞内活性氧含量测定
• 3 结果
• 3.1 SOD及白藜芦醇的抗氧化能力测定
• 3.2 包封率测定
• 3.3 SOD脂质体对肿瘤细胞及正常细胞的抑制作用
• 3.4 SOD脂质体作用对细胞内SOD活性的影响
• 3.5 SOD脂质体对细胞内活性氧含量影响
• 4 讨论
• 5 小结
• 第六章 总结与展望
• 参考文献
• 致谢