棕榈酸对大鼠INS-1β细胞的毒性作用及非诺贝特干预及机制研究

论文摘要

胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足是2型糖尿病发病的中心环节。代谢因素诸如糖毒性、脂毒性参与胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能衰竭的病理过程,是促进2型糖尿病发病的因素之一。长期游离脂肪酸升高可引起机体胰腺或离体胰岛的分泌功能障碍,即糖尿病发生的脂毒性学说。一方面增高的游离脂肪酸加剧胰岛p细胞的凋亡;另一方面脂质积聚在非脂肪组织,造成该组织的功能减退。Banting科学成就奖获得者McGarry教授甚至认为糖尿病是起源于脂代谢异常的“糖脂病”（Diabetes Mellipitus）,可见脂毒性在糖尿病发病中的重要作用。脂毒性机制及抗脂毒性药物成为当前研究热点。目前认为脂毒性机制主要包括几个方面:线粒体途径,过氧化物酶增殖物激活受体（PPAR）途径,氧化应激途径,神经酰氨途径等。近年来,对PPARα在脂毒性中的作用研究格外突出,主要有两种不同的观点:1.激活PPARα可介导脂肪酸的毒性作用;2.抑制PPARα从而抑制胰岛素释放。两者的具体机制均不清楚。非诺贝特是经典的降脂药物,可通过活化PPARα发挥作用。临床研究发现,使用贝特类降脂药除可降低血脂,还可改善部分糖尿病（DM）患者胰岛的基础高分泌状态和葡萄糖刺激后的胰岛素分泌。此作用除受益于改善周围组织胰岛素抵抗外,对胰岛β细胞是否有直接作用引起了我们的极大兴趣。PDX-1（Pancreas/Duodenum Homeobox-1）,即胰腺十二指肠同源异型盒因子-1,是胰腺β细胞胰岛素基因的转录调控因子,在胚胎发育期主要调控胰岛细胞分化,在成年哺乳动物中主要借助N末端与含TAAT序列的胰岛素基因启动子A1、A3位点结合,并引导胰岛素mRNA从细胞核转移到胞质中,调控胰岛素的转录、翻译和胰岛素颗粒释放,此外,PDX-1还能转录胰岛素和调控胰岛素相关基因如葡萄糖转运蛋白2（GLUT-2）和葡萄糖激酶（GK）等的表达,对胰岛细胞内分泌功能起重要调节作用。而葡萄糖刺激p细胞释放胰岛素,首先必须经细胞膜上GLUT-2蛋白转运进入细胞内,在葡萄糖激酶作用下磷酸化,经氧化分解代谢释放ATP,增加ATP/ADP比值,关闭ATP敏感的钾离子通道,使细胞膜去极化诱发钙离子内流和胰岛素颗粒释放。研究发现,游离脂肪酸（FFAs）可以抑制大鼠胰岛PDX-1表达,降低GLUT-2和胰岛素水平。但是其上游机制不清。AMPK（AMP-Activated Protein Kinase）,即AMP激活的蛋白激酶,是哺乳动物细胞能量代谢的一种重要的调节因子。AMPK最主要的生物学效应是通过感受胞浆内AMP/ATP比值的变化,调节脂肪酸的氧化代谢。在胰岛β细胞,葡萄糖可通过氧化代谢直接改变细胞内的腺苷酸水平,从而影响AMPK活性,表现为高糖抑制AMPK表达和活性。那么,高脂对B细胞AMPK的作用如何?目的:本研究利用体外培养的大鼠INS-1胰岛β细胞,以体内主要游离脂肪酸—棕榈酸（Palmitic acid,P）为代表,以非诺贝特（Fenofibrate,F）为PPARα激动剂,MK886（M）为PPARα阻断剂,对以下问题进行探讨:1.观察慢性棕榈酸处理对INS-1细胞的葡萄糖刺激的胰岛素释放功能的影响以及对PPARα、PDX-1、胰岛素、GLUT2 mRNA和蛋白表达的影响,探讨慢性脂毒性的机制。2.观察非诺贝特能否改善棕榈酸对INS-1细胞的胰岛素释放功能以及对PPARα、PDX-1、胰岛素、GLUT2mRNA和蛋白表达的影响,探讨非诺贝特改善脂毒性的机制。3.探讨在INS-1细胞中,PPARα与PDX-1的关系。4.观察慢性棕榈酸处理对AMPKα表达与活性的影响,探讨AMPKα在INS-1细胞脂毒性的地位与作用。方法:1.INS-1细胞的培养和分组:INS-1细胞在RPMI1640（添加10%FBS,2 mML-谷氨酸,50μMβ巯基乙醇）培养基中贴壁生长。实验分为六组:C组,正常对照组;P组,0.2 mM棕榈酸组;F组,5×10-6M非诺贝特;PF组,P与F共培养;M组,1×10-6M MK886;PM组,P与M共培养。处理时间:48小时。2.细胞形态的观察:INS-1细胞分组培养48h后,倒置显微镜下观察细胞形态变化。3.细胞活力的检测:INS-1细胞分组培养后,使用MTT方法检测细胞活力的变化。4.INS-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素释放功能的测定与评价:INS-1细胞种于24孔板中,分组处理48小时后,在葡萄糖浓度为3 mM、20 mM的KRB缓冲液分别孵育20min,收集上清,放射免疫方法测定分泌的胰岛素水平分别为基础胰岛素分泌（BIS）和葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）,计算GSIS/BIS比值即胰岛素释放指数（ISI）。5.PPARα、PDX-1、胰岛素、GLUT2的检测:Real-time PCR检测INS-1细胞PPARα、PDX-1、胰岛素、GLUT2 mRNA的表达。Western blot检测PDX-1、GLUT2蛋白表达。免疫沉淀检测PPARa蛋白表达。放射免疫方法检测细胞内胰岛素含量。免疫荧光检测PDX-1和胰岛素的定位与表达。凝胶迁移率试验（EMSA）检测PPARα与PDX-1的转录结合活性。6.RPMI1640培养过表达PDX-1的Pdx-1#6细胞株,加以不同浓度的强力霉素（Doxycyline）（0,75,150,500 ng/ml）,使PDX-1 mRNA及蛋白表达呈逐级递增表达,RT-PCR检测PPARα、胰岛素、GLUT2 mRNA表达的变化。7.AMPKα亚单位的检测:Real-time PCR检测INS-1细胞AMPKα1亚单位和AMPKα2亚单位的mRNA水平;Western blot检测总AMPKα单位（T-AMPKα）和磷酸化AMPKα（P-AMPKα）亚单位的蛋白水平。结果:1.细胞形态的观察:INS-1细胞属上皮型贴附细胞,呈扁平不规则多角形,有聚集生长倾向。光学显微镜显示,正常对照组细胞折光性极好,分组培养48h后,P组细胞贴壁良好,约60%的细胞表面可见圆形小泡,且细胞皱缩,形态变圆。F组细胞增殖良好,形态与正常对照组无区别。PF组细胞表面圆形小泡较P组减少但仍然多于对照组,细胞形态略有收缩趋势。2.细胞活力的检测:MTT结果显示,与正常对照组相比,P组细胞活力明显下降53%（p＜0.05）,PF组较P组改善,增高了74%（p＜0.05）,但仍比正常对照组低。F组与正常对照组比无明显差异。3.INS-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素释放功能的变化:与正常对照组相比,棕榈酸使BIS增加24%（p＜0.05）,使GSIS降低至正常对照的86%（p＜0.05）,ISI比值由正常的2.34倍降至1.69倍（p＜0.05）,提示棕榈酸对INS-1细胞功能的损伤作用。加入非诺贝特后,与P组相比,PF组使棕榈酸引起的增高的BIS下降27%（p＜0.05）,同时也提高了GSIS和ISI,分别为P组的1.14倍和1.56倍（p＜0.05）,提示非诺贝特对INS-1细胞脂毒性的改善作用。而单独F组与对照组相比ISI提高12%（p＜0.05）,PM组和M组分别使BIS增高56%和34%（p＜0.05）,使ISI降低58%和69%（p＜0.05）。4.对PPARα,PDX-1,胰岛素,GLUT2表达的影响与对照组相比,P组PPARαmRNA表达下降了38%,蛋白表达下降了58%（p＜0.05）,PDX-1 mRNA表达下降46%（p＜0.05）,蛋白表达下降49%（p＜0.05）,PDX-1的下游基因胰岛素和GLUT2 mRNA表达分别下降41%和54%（p＜0.05）,蛋白表达也相应降低29%和31%（p＜0.05）。免疫荧光检测PDX-1和胰岛素结果显示,PDX-1主要表达在胞核,胰岛素仅表达在胞浆,二者的荧光强度在P组较正常对照组明显减弱。提示高脂环境可降调PPARα,PDX-1和PDX-1下游指标胰岛素和GLUT2的表达,损伤胰岛素释放功能。与P组相比,PF组PPARαmRNA表达增高了61%,蛋白表达增高157%（p＜0.05）。PDX-1 mRNA表达增加61%,蛋白表达增高78%（p＜0.05）。胰岛素和GLUT2 mRNA表达分别增加114%和61%（p＜0.05）,蛋白表达增加68%和179%（p＜0.05）。免疫荧光显示PDX-1和胰岛素染色明显增强。提示非诺贝特作为PPARα的激动剂,能够提高PPARα的表达,同时上调PDX-1和其下游胰岛素和GLUT2的表达,改善胰岛β细胞脂毒性。为探讨PPARα是否能够调节PDX-1的表达,我们使用了PPARα的阻断剂MK886,结果发现,与正常对照组相比,单纯M组使PPARαmRNA表达下降66%（p＜0.05）,同时使PDX-1 mRNA和蛋白表达分别下降54%和53%（p＜0.05）,胰岛素和GLUT2 mRNA和蛋白水平也相应下降。免疫荧光显示PDX-1和胰岛素染色明显变暗。而与P组相比,PM组能使上述降低达到最大值。表明在生理和高脂的病理情况下,PPARα可以阳性调节PDX-1的表达,这可能是高脂引起β细胞功能损害的机制之一。为进一步明确PPARα与PDX-1之间的关系,我们使用了另外一种过表达PDX-1的细胞株Pdx-1#6细胞,加用不同剂量的强力霉素Doxycyline（0,75,150,500 ng/ml）,使PDX-1蛋白呈逐级递增的表达,发现胰岛素和GLUT2均随PDX-1表达的增加而增加,明确了PDX-1对胰岛素和GLUT2表达的调节,但是没有观察到PPARαmRNA表达的变化,提示PPARα不受PDX-1的调节。为明确PPARα调节PDX-1表达的具体作用层面,我们采用EMSA试验检测PPARα转录结合水平的变化,发现棕榈酸降低PPARα的转录结合,加入非诺贝特后明显改善。在PPARα与PDX-1的转录结合实验中,我们发现PDX-1的启动子上有PPAR结合反应元件（PPRE）,EMSA结果显示PPARα与PDX-1的启动子上的PPRE序列存在直接结合,这种结合作用在P组降低,PF组增高。提示PPARα可能通过与PDX-1的直接结合,进而调节PDX-1的表达,影响INS-1细胞胰岛素释放功能。5.对AMPK表达与活性的影响:与正常对照组相比,棕榈酸使INS-1细胞T-AMPKα亚单位蛋白水平降低34%（p＜0.05）,使P-AMPKα蛋白水平降低38%（p＜0.05）,提示棕榈酸可以降调AMPKα基的表达和活性;mRNA水平分析结果显示,棕榈酸显著降调AMPKα1亚基的表达（比正常组下降40%,p＜0.05）,增加AMPKα2亚基的表达,进一步提示主要是AMPKα1亚基参与高脂诱导的胰岛细胞功能损伤的发生。与棕榈酸组相比,PF组分别使T-AMPKα和P-AMPKα的蛋白表达提高40%和52%（p＜0.05）,AMPKα1亚单位的mRNA水平增加26%（p＜0.05）,而AMPKα2亚单位无明显变化,进一步表明AMPKα1 mRMA水平的增加引起AMPK总蛋白的表达和活性的增加,这可能与非诺贝特改善INS-1细胞脂毒性密切相关。单独F组细胞与正常对照相比,未见AMPKαmRNA和蛋白表达的明显改变。结论:①在生理或病理状态（高脂环境）下的INS-1细胞中,PPARα可以阳性调节PDX-1的表达,并且这种调节可能是通过PPARα与PDX-1启动子的直接结合发挥作用的。②慢性棕榈酸处理可抑制PPARα,降调PDX-1及下游信号的表达,使INS-1细胞葡萄糖刺激的胰岛素释放功能受损。③非诺贝特可改善棕榈酸对INS-1细胞胰岛素释放功能的损伤作用,可能是通过激活PPARα表达,上调PDX-1及其下游信号的表达发挥作用的。④慢性棕榈酸处理可降调AMPKα亚基的表达和活性,提示AMPKα亚基可能参与了高脂对β细胞的毒性作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 第一部分 棕榈酸对INS-1β细胞的毒性作用及非诺贝特干预及机制研究:调节PPARα/PDX-1通路
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 第二部分 棕榈酸下调大鼠INS-1β细胞AMPKα活性抑制葡萄糖刺激的胰岛素释放
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 致谢
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