产紫杉醇菌种的改良及若干种前体物质作用的研究

论文摘要

紫杉醇是一种二萜类衍生化合物,最早从红豆杉属植物中分离出来。由于其抗癌机制独特,对多种恶性肿瘤疗效突出,一直备受人们的关注。利用植物内生真菌发酵法产生紫杉醇是近年来研究热点,由于产量性状不能满足生产要求,提高真菌发酵液中紫杉醇的产量是当今及以后研究工作的重心。而高产菌种选育、优化培养条件将是提高紫杉醇产量的有效途径。本论文在实验室保藏的一株紫杉醇产生菌Fusarium mairei K178基础上,以发酵生产紫杉醇的产量提高为目标,对其生物合成前体、育种途径、发酵工艺做进一步研究。主要研究方法和结果如下:1.研究同时添加不同前体物对菌体合成紫杉醇的影响,采用响应面法对美丽镰刀菌（Fusarium mairei K178）发酵合成紫杉醇途径中一些可能的前体进行优化研究。首先采用Plackett-Burman法对8个因素进行了筛选,结果表明,苯丙氨酸,苯甲酸钠和乙酸钠三个因素对紫杉醇产量影响较大。在此基础上,再通过Box-Behnken设计,利用Design-Expert软件进行二次回归分析,得到各因素的最佳浓度为:苯丙氨酸2.8 mg/L,苯甲酸钠31.8 mg/L,乙酸钠3.3 g/L。在优化条件下紫杉醇的产量达到242.6μg/L,较前体单因素实验最高值提高15.6%,并对前体合成紫杉醇机理进行了研究。2.采用紫外线与亚硝酸对美丽镰刀菌（Fusarium mairei）K178的孢子进行复合诱变,于含40μg/mL制霉菌素的平板上进行筛选,获得31株突变株,其中5株的紫杉醇产量高于出发菌株,突变株UH23的紫杉醇产量为259.8μg/L,较出发菌株提高了17.8%。3.研究了突变株Fusarium maireiUH23发酵产紫杉醇的工艺条件,实验结果表明最佳培养条件为:温度26℃,发酵起始pH 7.0,接种量5%,250 mL三角瓶装液60 mL,发酵周期12 d。筛选了最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为硝酸铵。得到最佳发酵培养基组成（g/L）:葡萄糖60,NH4NO3 6,无水MgSO4 0.3,KH2PO4 0.5, ZnSO4 1×10-3,Cu（NO3） 2 1×10-3,FeCl3 2×10-3,VB1 5×10-2,苯丙氨酸2.8×10-3,苯甲酸钠31.8×10-3,乙酸钠3.3,L-酪氨酸5×10-3。紫杉醇含量达到305.9μg/L。硝态氮和铵态氮二者对菌体合成紫杉醇具有协同作用。在发酵第6 d补加蔗糖,在蔗糖含量在不高于10 g/L时对菌体生长和紫杉醇积累具有促进作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 紫杉醇概述
• 1.2 紫杉醇生物合成路径
• 1.3 紫杉醇生产现状
• 1.3.1 化学半合成及全合成
• 1.3.2 植物细胞离体培养法
• 1.3.3 微生物转化法
• 1.3.4 微生物发酵方法
• 1.4 本论文的主要研究内容
• 1.4.1 提高内生真菌产紫杉醇产量需解决的问题
• 1.4.2 本论文的主要研究内容
• 第二章 前体化合物对真菌合成紫杉醇的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 药品与试剂
• 2.2.4 主要仪器
• 2.2.5 培养方法
• 2.2.6 紫杉醇提取方法
• 2.2.7 紫杉醇含量测定
• 2.3 实验设计
• 2.3.1 Plackett-Burman 实验设计
• 2.3.2 响应面实验设计
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 影响紫杉醇合成重要前体物质的确定
• 2.4.2 最陡爬坡实验接近最大响应面区域
• 2.4.3 响应面优化重要因素的最佳浓度
• 2.5 本章小结
• 2.6 讨论
• 第三章 紫杉醇产生菌Fusarium mairei K178 的诱变育种
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂
• 3.2.4 主要仪器
• 3.2.5 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 制霉菌素最小抑制浓度的选择
• 3.3.2 紫外线和亚硝酸复合诱变处理
• 3.3.3 突变株的筛选
• 3.3.4 突变株的遗传稳定性
• 3.3.5 出发菌与突变菌的性状差异
• 3.4 本章小结
• 第四章 紫杉醇产生菌发酵条件的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌种
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 主要仪器
• 4.2.4 培养方法
• 4.2.5 紫杉醇的提取及测定方法
• 4.2.6 生物量的测定方法
• 4.2.7 其他分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 葡萄糖标准曲线的绘制
• 4.3.2 最适培养温度和初始pH 的选择
• 4.3.3 接种量对紫杉醇产量和生物量的影响
• 4.3.4 装液量对紫杉醇产量和生物量的影响
• 4.3.5 培养时间对紫杉醇产量的影响
• 4.3.6 培养基中碳、氮源的研究
• 4.3.7 培养基正交试验的研究
• 4.3.8 Fusarium maireiUH23 摇瓶发酵过程曲线
• 4.3.9 培养基补加蔗糖的研究
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文