论文摘要
胰腺癌临床预后差,其原因是缺乏特异性的肿瘤标记物和有效的治疗措施,找到具有诊断价值的特异性肿瘤标志物和有效治疗靶点成为诊断、治疗胰腺癌的重要措施之一。本课题组在对胆管癌肿瘤分子生物学的研究中发现离子通道相关蛋白FXYD6具有促进胆管癌细胞增殖的作用,鉴于胰腺和胆管有着共同的胚胎学起源和组织学特征,两者的病理分型、转移及临床预后等方面也有着诸多的相似之处,我们推测FXYD6在胰腺癌的发生和发展中可能具有重要的作用。目的:（1）制备并鉴定抗人FXYD6 McAb和FXYD6shRNA表达载体,为进一步研究FXYD6的组织分布和生物学作用创造条件。（2）观察FXYD6在胰腺癌中的表达情况,分析其与临床病理学特征的相关性。（3）观察载体介导的FXYD6 shRNA对胰腺癌细胞增殖的影响,评价FXYD6作为靶基因的治疗效果,为胰腺癌基因治疗的可能性提供实验基础。方法:（1）利用FXYD6合成多肽作为免疫原,应用单克隆抗体杂交瘤技术建立阳性克隆细胞株,腹水诱导法生产抗人FXYD6 McAb,蛋白A亲合层析法纯化,ELISA测定FXYD6 McAb的特异性和效价。（2）收集手术切除的47例胰腺癌标本和正常胰腺组织6例,应用免疫组化法检测FXYD6蛋白在胰腺癌及在正常胰腺组织中的表达水平,并分析其与临床病理因素的关系。（3）利用生物信息学方法设计RNAi干扰靶点,体外化学合成基于microRNAmir-30的FXYD6 shRNA,并构建于pCGM30载体,筛选阳性克隆经并经基因测序鉴定。（4）将胰腺癌细胞sw1990分为7组:未转染细胞对照组、空白对照组、空载体对照组、FXYD6 shRNA实验组（pCGM30-FXYD6shRNA-1～4）,以Lipofectamine 2000为介导将FXYD6 shRNA表达载体转染至胰腺癌细胞sw1990,MTT评价转染FXYD6 shRNA表达载体后对胰腺癌细胞sw1990增殖能力的抑制作用,Western-blot法检测胰腺癌细胞sw1990中FXYD6蛋白表达水平的变化。结果:（1）成功获得1株稳定分泌特异性抗人FXYD6 McAb的杂交瘤细胞株,腹水诱导法生产抗人FXYD6 McAb 2.86mg,FXYD6 McAb可以与FXYD6合成多肽特异性结合,抗体效价1:5400。（2）47例胰腺癌病例中,FXYD6蛋白阳性表达42例,阳性表达率为89.34%,而正常胰腺组织中不表达或低表达,两种组织中FXYD6表达差异有显著统计学意义（P＜0.05）;按FXYD6蛋白表达程度将47例胰腺癌病例分为高表达组和低表达组,两组之间肿瘤分化程度、淋巴转移、TNM分期的差异有显著统计学意义（P＜0.05）,而年龄、性别、肿瘤大小及远处转移的差异无统计学意义（P＞0.05）,肿瘤分化程度低、出现淋巴转移、TNM分期为Ⅲ-Ⅳ期的胰腺癌组织中FXYD6蛋白表达明显增高;Spearman等级相关分析显示,FXYD6蛋白表达程度与肿瘤大小、分化程度、淋巴转移、远处转移相关（P＜0.05）。（3）基于microRNA mir-30天然结构,设计合成了4对FXYD6shRNA干扰片断并插入pCGM30,成功构建并经基因测序鉴定了4个FXYD6shRNA的表达载体pCGM30-FXYD6 shRNA。（4）转染后24h、48h和72h,实验组中胰腺癌细胞sw1990的细胞增殖能力和FXYD6蛋白表达均比对照组降低（P＜0.05）,但各对照组、实验组之间细胞增殖与FXYD6蛋白表达的差异无统计学意义（P＞0.05）;实验组中胰腺癌细胞sw1990细胞增殖抑制程度随时间延长而逐渐增强（P＜0.05）,同时FXYD6蛋白表达逐渐降低（P＜0.01）。结论:（1）成功获得抗人FXYD6 McAb和pCGM30-FXYD6 shRNA,为进一步研究FXYD6的组织分布、生物学作用创造了条件。（2）FXYD6可能促进胰腺癌的增殖与转移,影响肿瘤分化。（3）测定FXYD6蛋白的表达程度有助于术中胰腺癌的正确分期,对于手术方式及范围具有指导意义。（4）抑制胰腺癌细胞sw1990中FXYD6的表达可以抑制细胞增殖,提示FXYD6可能是一个具有潜在临床应用价值的基因治疗靶点。