利用SCOTS技术筛选鸭疫里氏杆菌体内外差异表达的基因

论文摘要

鸭疫里氏杆菌病是由鸭疫里氏杆菌（Riemerella anantipestifer,RA）引起的一种接触性或慢性、败血性传染病,给养鸭业造成了巨大的经济损失,是目前危害世界各国养鸭业最为严重的传染病之一。目前,对于RA的毒力因子以及致病的分子基础报道甚少,因此,本研究用选择性捕获转录序列（SCOTS）技术筛选鸭疫里氏杆菌在感染过程中特异性表达的基因,在分子水平上探讨RA的致病机理,为鸭疫里氏杆菌病的免疫预防和治疗提供理论基础。用常规方法提取了鸭疫里氏杆菌基因组,扩增出16S、23S rDNA,并对全基因组进行了生物素标记,采用超声波裂解方法将16S、23S rDNA和基因组生物素标记混合物进行裂解,获得了片段大小在100～2000bp之间的含16S、23S rDNA的RA基因组随机标记片段。以本实验室分离、鉴定的血清1型鸭疫里氏杆菌云梦分离株（RA-YM）感染7日龄樱桃谷肉鸭,提取感染鸭肝脏和TSB培养RA-YM的总RNA,合成cDNAs,分别记为体内感染库和体外培养库。应用SCOTS技术对体内感染库和体外培养库进行均一化处理以及基于PCR方法的体内感染特异性转录序列的选择性富集,选择性富集的体内感染特异性转录序列经过扩增与T载体连接,挑取阳性克隆进行测序。结果表明,本研究获得了16个RA在体内感染过程中特异性表达的基因,经对测序结果进行生物信息学分析,可将上述特异性表达基因分为六类:合成与代谢,适应性调节,应激,转运系统,蛋白酶和未知功能序列。细菌的蛋白酶是病原菌重要的毒力因子,本研究筛选到2个编码蛋白酶的基因,即二肽肽酶Ⅳ（dppⅣ）和锌依赖的肽酶（zdp）。格氏链球菌（Streptococcus gordonii）DPPⅣ可以酶解P物质,同时协同胞外精氨酸蛋白酶酶解缓激肽,导致血管通透性的变化以及感染的内皮组织平滑肌收缩。纤维素性渗出是鸭疫里氏杆菌感染的主要病理变化,因此,二肽肽酶Ⅳ可能是RA引起雏鸭腹腔浆膜面广泛性渗出的关键性毒力因子之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 概述
• 2 病原学
• 2.1 分类地位
• 2.2 RA的形态和染色特性
• 2.3 培养基和理化特性
• 2.4 血清型
• 3 流行病学
• 3.1 易感动物
• 3.2 传染源和传播途径
• 3.3 发病季节和诱病因素
• 3.4 发病日龄
• 4 临床症状与病理变化
• 4.1 临床症状
• 4.2 病理变化
• 5 诊断方法
• 5.1 细菌的分离鉴定
• 5.2 凝集试验
• 5.3 酶联接免疫吸附剂测定
• 5.4 荧光抗体技术
• 5.5 PCR
• 6 免疫原性研究
• 7 致病因子研究
• 8 细菌体内基因差异表达技术
• 8.1 体内表达技术（IVET）
• 8.2 代表性差别分析技术（RDA）
• 8.3 信号标签技术（STM）
• 8.4 选择性捕获转录序列（SCOTS）
• 8.4.1 SCOTS技术的原理
• 8.4.2 SCOTS技术路线
• 8.4.3 SCOTS技术的优缺点
• 第二章 鸭疫里氏杆菌基因组的提取、生物素标记以及16S rDNA和23S rDNA的克隆
• 1 研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和工具酶
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要试剂及溶液的配制
• 2.1.4 本试验所采用的PCR引物
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 RA-YM基因组的提取及标记
• 2.2.2 16S rDNA的PCR扩增
• 2.2.3 23S rDNA的PCR扩增
• 2.2.4 PCR产物回收与测序
• 2.2.5 PCR产物的克隆
• 2.2.6 感受态细胞制备（氯化钙法）
• 2.2.7 质粒的转化
• 2.2.8 质粒的小量制备（碱裂解法提取质粒）
• 2.2.9 重组质粒的鉴定
• 2.2.10 16S rDNA和23S rDNA的PCR扩增结果分析
• 2.2.11 含16S、23S rDNA质粒的RA基因组随机标记片段的制备
• 3 结果与分析
• 3.1 RA-YM基因组
• 3.2 16S rDNA的PCR扩增及酶切鉴定
• 3.2.1 16S rDNA的PCR扩增
• 3.2.2 16S rDNA的酶切鉴定
• 3.3 23S rDNA的PCR扩增（分三段扩增）及酶切鉴定
• 3.3.1 23S rDNA的PCR扩增
• 3.3.2 23S rDNA的酶切鉴定
• 3.4 RA基因组及rDNA质粒的破碎
• 4 讨论
• 4.1 RA基因组的提取及标记
• 4.2 PCR扩增
• 4.3 质粒的酶切鉴定
• 5 小结
• 第三章 选择性捕获转录序列
• 1 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验仪器
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 试验菌株和试验动物
• 2.1.4 本实验所使用的引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RA-YM的复苏
• 2.2.2 RA-YM的感染试验及样品采集
• 2.2.3 组织总RNA的提取
• 2.2.4 细菌总RNA的提取
• 2.2.5 cDNA合成
• 2.2.6 cDNAs的纯化回收
• 2.2.7 预杂交
• 2.2.8 转录序列捕获（SCOTS）
• 2.2.9 RA感染过程中特异性转录cDNAs的富集
• 2.2.10 RA感染过程中特异性转录cDNAs的克隆
• 2.2.11 细菌转化
• 2.2.12 cDNA克隆筛选
• 2.2.13 斑点杂交
• 2.2.14 阳性克隆cDNA片段测序及序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 肝脏总RNA的提取及cDNA的合成
• 3.2 RA总RNA的提取及cDNA合成
• 3.3 选择性捕获转录序列（Selective capture of transcribed sequences）
• 3.4 RA在感染过程中特异性转录序列的富集
• 3.5 SCOTS所捕获的差异cDNA克隆
• 3.6 斑点杂交结果
• 3.7 阳性克隆cDNA片段测序及序列预测分析
• 4 讨论
• 4.1 SCOTS
• 4.2 RA体内感染差异表达的基因
• 4.2.1 与代谢相关的基因
• 4.2.2 适应性反应相关的基因
• 4.2.3 蛋白酶类基因
• 4.3 下一步工作计划
• 5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢