人免疫缺陷性病毒基因重组脊髓灰质炎病毒疫苗的实验研究

论文摘要

艾滋病是由人免疫缺陷病毒（HIV）引起的一种传染病,以破坏人体的免疫功能为致病特征,以性接触、血液传播为主,目前在全球的蔓延呈不断扩大的趋势。虽然药物治疗对一部分患者有效,但价格十分昂贵,且易复发、产生耐药。而绝大部分患者在经济落后的发展中国家,因此研制价格便宜、接种方便的有效HIV疫苗是当务之急。目前研制的HIV疫苗种类很多,既有传统的病毒病毒失活疫苗、减毒活疫苗,也有新型的核酸疫苗、合成肽链疫苗、病毒载体疫苗等,但在临床试验效果均不理想。原因可能与HIV的高度变异、致病机理尚不清楚、抗体滴度不高多种因素有关。鉴于艾滋病主要以粘膜途径传播为主,研制一种能刺激机体产生较强粘膜免疫能力的疫苗可能对预防HIV的传播起重要作用。脊髓灰质炎病毒（PV）是一类单股正链RNA病毒,具有自主的复制能力。减毒的Sabin株疫苗在防止脊髓灰质炎多年的防疫实践中证实安全、有效,以口服途径为主,有较好的粘膜免疫诱导功能。为此,本研究拟以减毒的脊灰病毒SabinⅠ为载体,以HIV中国主要流行病毒株的基因为抗原,研制一种有实际推广价值的HIV疫苗。首先以HIV-1CN54株gagpol基因的cDNA为模板,通过PCR反应获得了gagprotease基因片段,并于其两端带上合适的酶切位点。将携带脊灰病毒cDNA的真核表达质粒载体通过酶切反应,将PV位于两个单一酶切位点的结构基因部分片段予以切除,而后由酶连接反应将HIV-1的gagprotease抗原基因片段与PV的cDNA酶切后的粘性末端进行连接,并保持了正确的阅读框架,经双酶切反应证实被正确地定向插入了载体上。对培养的Hela细胞,将重组的表达载体与由真核表达载体反式提供的PV结构基因实行共转染,实现缺陷性脊灰病毒的细胞内重新组装,并在电子显微镜下观察,发现细胞内有重组病毒产生。经显微镜下对转染的细胞连续观察48小时,未发现有明显的细胞病变效应。由于此重组缺陷病毒不产生子代病毒,没有传染性,因而有较好的生物安全性。对培养的人二倍体细胞进行扩大培养,大规模生产重组病毒疫苗。采用蔗糖梯度离心法分离、纯化病毒颗粒,后以RT-PCR、WesternBlot对其进行鉴定,证实该病毒基因组带有抗原基因,壳蛋白呈典型的PV结构。使其对Hela细胞进行感染性、表达检测,发现能在细胞内正确表达抗原基因。本实验另将HIV-1gagprotease基因插入了真核表达载体的多克隆位点上,制备了一个DNA疫苗,并采用脂质体技术转染细胞,以免疫荧光技术证实它能在细胞内有HIV抗原蛋白产生。在随机分配的脊灰受体转基因小鼠身上,以研制的两种疫苗分别隔月进行了三次经鼻腔粘膜免疫接种,以ELISA法检测IgG、IgA体液免疫反应,以乳酸脱氢酶释放试验检测淋巴细胞免疫效应,结果显示重组的脊灰病毒疫苗整体诱导的免疫效果均DNA疫苗要好,部分结果相比差异有统计学意义,且差异显著;部分差异不太明显。此结果可能与其感染性较强、能在细胞能多次复制表达抗原能力较高相关。未发现疫苗有明显的毒性作用。结论:HIV抗原基因重组的缺陷性脊髓灰质炎疫苗有较好的免疫原性,对预防艾滋病的传播应有较好的应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 HIV-1gagprotease基因重组缺陷性脊髓灰质炎病毒疫苗的研制
• 1.1 前言
• 1.1.1 HIV及爱滋病简介
• 1.1.2 疫苗的选择
• 1.1.3 HIV抗原基因的选择
• 1.2 实验技术路线
• 1.3 实验材料
• 1.3.1 质粒与菌株
• 1.3.2 细胞
• 1.3.3 实验试剂
• 1.3.4 工具酶、抗体
• 1.3.5 实验仪器
• 1.3.6 溶液的配备
• 1.4 HIV-1gagprotease基因重组缺陷性脊髓灰质炎病毒疫苗的初步构建和检测
• 1.4.1 引言
• 1.4.2 实验方法
• 1.4.3 实验结果
• 1.5 HIV-1gagprotease基因重组缺陷性脊髓灰质炎病毒疫苗的制备、纯化和鉴定
• 1.5.1 引言
• 1.5.2 实验方法
• 1.5.3 实验结果
• 1.6 讨论
• 1.6.1 RNA复制子疫苗的特点
• 1.6.2 脊髓灰质炎病毒的分子生物学性状
• 1.6.3 粘膜免疫反应
• 1.6.4 脊髓灰质炎病毒的生物毒性
• 1.6.5 减毒的PV Sabin株
• 1.6.6 HIV-1gagprotease基因表达产物的免疫原性
• 1.6.7 重组PV在细胞内的组装
• 1.6.8 存在的问题
• 第二章 HIV-1gagprotease基因DNA疫苗的构建和制备
• 2.1 引言
• 2.2 实验技术路线
• 2.3 实验材料
• 2.4 实验方法
• 2.5 实验结果
• 2.6 讨论
• 第三章 HIV-1gagprotease基因重组脊髓灰质炎病毒疫苗、核酸疫苗免疫效果的研究
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.3 实验方法
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 靶细胞系的筛选
• 3.4.2 体液免疫反应检测
• 3.4.3 粘膜免疫反应检测
• 3.4.4 淋巴细胞免疫反应的检测
• 3.4.5 疫苗的毒性反应监测
• 3.5 讨论
• 实验参考文献
• 综述一 艾滋病疫苗研究进展
• 综述一 参考文献
• 综述二 基于脊髓灰质炎病毒的表达载体研究进展
• 综述二 参考文献
• 附录1 HIV-1gagprotease基因重组的脊髓灰质炎病毒基因组序列
• 攻读学位期间主要的研究成果
• 致谢