论文摘要
M电流是由Brown及Adams于1980年首次在牛蛙颈上交感神经节中发现的一种具有电压依赖性、慢激活、非失活、慢去活等特征的外向钾电流。由于这种外向钾电流可被M型受体激动剂毒蕈碱（Muscarine）强烈抑制,因而得名为M电流,其离子通道称为M通道。目前人们认为KCNQ家族成员（KCNQ2-5）构成的同源四聚体或异四聚体是构成M通道的分子基础。以KCNQ为分子基础的M电流对于维持和稳定神经元的兴奋性发挥着重要作用。M电流被抑制后,细胞膜发生去极化,使膜电位更接近阈电位,细胞更易爆发动作电位,神经元的兴奋性增加。研究发现,KCNQ2和KCNQ3基因突变可诱发由于神经元过度兴奋所致的家族遗传性新生儿惊厥症（benign familial neonatal convulsions, BFNC）和癫痫等疾病。最近研究发现,神经元M电流还参与外周疼痛感觉的信号转导和神经性疼痛。因而,研究和开发KCNQ钾通道的开放剂对于治疗这些中枢兴奋性疾病和疼痛具有重要意义。以KCNQ通道为分子作用靶点的新型抗癫痫化合物的研究已经成为神经科学领域的一大热点,并取得重要进展。瑞替加滨（retigabine）就是在该背景下所研制出的代表性的一类新型抗癫痫药。最近研究发现其他化学结构化合物,如羟基吲哚类似物BMS-204352,灭酸类化合物如甲氯芬那酸、双氯芬酸和NH6,吡硫锌,ICA-27243以及ICA-105665等也是KCNQ通道的强激活剂。以KCNQ通道为分子作用靶点为研发治疗癫痫和惊厥等中枢兴奋性疾病药物开辟了新的方向。我室联合本校新药研发中心合成了一系列针对KCNQ通道为分子作用靶点的全新结构化合物,通过原子吸收Rb+流出测定的高通量筛选技术初步寻找到若干对KCNQ通道具有激活作用的化合物。本论文主要利用全细胞膜片钳技术详细系统地研究这些激活剂（主要是QO-26、QO-28、QO-40和QO-41四种化合物）对KCNQ2/3通道的作用,探讨不同结构化合物对KCNQ2/3通道作用的构效关系与作用机制,从而为进一步研究和开发高效、安全的KCNQ通道激活剂奠定基础。论文具体内容如下：第一部分CHO细胞中稳定表达的KCNQ2/3钾离子通道电流的鉴定目的：对转染KCNQ2/3通道蛋白的CHO细胞稳转系统进行验证,建立研究KCNQ2/3通道电流的方法,为下一步研究药物对通道的作用奠定基础。方法：采用分子生物学western blot方法对CHO细胞中KCNQ2和KCNQ3蛋白的表达进行测定,以两性霉素B为打孔剂采用穿孔全细胞膜片钳技术观察通道电流特征和药理学特性。结果：（1）应用western blot方法,在蛋白水平同时检测到KCNQ2和KCNQ3的表达,分子量约97 kDa。此外,以空白CHO细胞为阴性对照,未检测到两种通道蛋白的表达。电生理学结果表明,在未转染通道的CHO细胞上,未记录到KCNQ2/3电流,而在稳转细胞上记录到特征明显的KCNQ2/3电流。该实验结果表明KCNQ2和KCNQ3共表达于CHO细胞中,且功能正常。（2）以如下程序记录KCNQ2/3电流。将膜电位钳制于-80 mV,然后以10 mV的阶跃电压将去极化电位由-130 mV逐步增加至+60 mV,然后将电压复极化至-120 mV。在此电压钳制程序之下,在去极化激活通道的过程中,随着去极化电压的增大,稳态激活电流也随之增大,且无明显失活,即电流呈现慢激活、非失活、电压依赖性特征,初步证明KCNQ2/3通道稳定表达于CHO细胞中。记录一系列从不同去极化电压（-130 mV-+60 mV）复极化至-120 mV所产生的内向尾电流,即可测得不同去极化电压激活通道的程度。用Boltzmann方程拟合尾电流-电压关系曲线,求得通道的半数激活电压V1／2为-2.2±1.5 mV,曲线斜率因子k为21.7±1.2。对激活电流曲线用单指数方程进行拟合,即可得到不同激活电压下通道的激活时间常数（Tauact）。KCNQ2/3通道的激活时间常数具有电压依赖性,随着激活电压的增大,激活时间常数缩短,通道开放速率加快。将膜电位钳制于-80 mV,然后给予一段前置去极化电压（+40mV）使通道以最大程度充分激活,然后以10 mV的阶跃电压将钳制电位由0 mV逐步降低至-140 mV,可见通道逐渐去活的变化,去活曲线用单指数方程进行拟合,即可得到不同激活电压下通道的去活时间常数（Taudeact）。通道在较负电压下（-140 mV--100 mV）去活时程较快,而在较正电压下（-90 mV--20 mV）去活时程较慢,提示随着去活电压的增大,通道去活速率减慢。（3）钾通道阻断剂对KCNQ2/3电流的影响：M通道的特异性阻断剂linopirdine可浓度依赖性地抑制KCNQ2/3电流,最大抑制率为95.5±1.1%,半数抑制浓度IC50为0.8±0.08μM, Hill系数为0.91±0.06。TEA可浓度依赖性地抑制KCNQ2/3电流,最大抑制率为92.92±1.6%,半数抑制浓度IC50为1.76±0.08 mM, Hill系数为1.01±0.05。结论：Western blot和电生理实验表明KCNQ2和KCNQ3共表达于CHO细胞中,通道电流的电生理学特征及药理学特性均符合KCNQ2/3电流特征,说明KCNQ2/3稳定表达于CHO细胞中,该细胞系可用于后续实验研究。第二部分吡唑并嘧啶酮类化合物对KCNQ2/3通道作用的构效关系研究目的：测定四种不同结构的吡唑并嘧啶酮类化合物（QO-26、QO-28、QO-40和QO-41）对稳转的KCNQ2/3通道电流作用的效能和效价,并与阳性对照药retigabine（RTG）的作用进行比较,从而分析该系列化合物作用于KCNQ2/3通道的构效关系。观察吡唑并嘧啶酮类化合物对大鼠背根神经元的M通道电流的影响。方法：主要以两性霉素B为打孔剂采用穿孔全细胞膜片钳技术观察化合物对KCNQ2/3电流或M电流的调节作用。结果：（1）QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能浓度依赖性地增大KCNQ2/3电流,具有通道开放剂特征。四种化合物对KCNQ2/3电流的作用表现出不同的效能和效价特征。分别观察了四种化合物对在-40 mV和-20 mV下记录的KCNQ2/Q3电流激活作用的的半数有效浓度（EC50）及最大作用。QO-26的EC5o分别为47.93±5.04μM和21.35±2.24μM；增大电流的最大倍数分别为4.76±0.67和1.04±0.16。QO-28的ECso分别为31.51±6.66μM和12.57±4.21μM；增大电流的最大倍数分别为13.36±2.07和2.68±0.4。QO-40的ECso分别为15.4±0.56μM和6.10±1.83μM；增大电流的最大倍数分别为6.60±1.73和0.78±0.07。QO-41的EC5o分别为9.04±1.53μM和3.27±0.47μM；增大电流的最大倍数分别为8.44±1.55和1.50±0.12。阳性对照药retigabine的EC5o分别为2.93±0.25μM和1.90±0.06μM；增大电流的最大倍数分别为11.86±0.95和2.95±0.32。（2）QO-41能增大大鼠小直径背根神经元上的M电流,其在-60 mV作用下的半数有效浓度EC50为7.09±1.8μM。结论：（1）吡唑并嘧啶酮类化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能增大表达于CHO细胞中的KCNQ2/3电流,且具有浓度依赖性。其中QO-28的效能最强,其对KCNQ2/3通道的作用程度与阳性对照药retigabine相当；QO-41的效价最高,但弱于阳性对照药retigabine。以QO-41为代表的吡唑并嘧啶酮类化合物也能浓度依赖性地增大大鼠小直径背根神经元上的M电流。（2）通过对一系列吡唑并嘧啶酮类化合物的构效关系研究表明,以吡唑并嘧啶酮为母核的化合物,其2位上的吸电子基团三氟甲基（CF3）,3位上的芳香基团苯环或萘环以及5位上的吸电子基团一氯甲基（CH2Cl）或三氟甲基（CF3）是维持化合物活性所必须的基团,且三氟甲基的活性强于一氯甲基,说明5位取代基团吸电子能力越强,其化合物活性也越好。第三部分吡唑并嘧啶酮类化合物对KCNQ2/3通道作用的机制研究目的：测定四种不同结构的吡唑并嘧啶酮类化合物（QO-26、QO-28、QO-40和QO-41）对KCNQ2/3通道激活和去活过程的影响,并采用联合给药和测定突变体KCNQ2（W236L）电流的方法初步研究化合物作用于KCNQ2/3通道的分子机制。方法：主要以两性霉素B为打孔剂采用穿孔全细胞膜片钳技术观察化合物对KCNQ2/3电流或KCNQ2（W236L）电流的调节作用。结果：（1）给予最大浓度的四种化合物和retigabine,分析其对KCNQ2/3电流-电压关系曲线的影响,发现上述药物在KCNQ2/3电流激活阈电位至+60 mV电压范围内,均能使KCNQ2/3稳态激活电流幅度增大,并使阈电位水平向超极化方向移动,即在化合物的作用下,KCNQ2/3通道在更负的电压下即可开放。（2）给予最大浓度的四种化合物,均能明显使KCNQ2/3的激活曲线向超极化方向移动,半数激活电压V1/2的变化值依次为200μM QO-28 （-34.2 mV）>100μM QO-40 （-21.11 mV）>300μM QO-26 （-18.14 mV）>100μM QO-41 （-16.92 mV）。阳性对照药30μM RTG的半数激活电压V1/2的左移程度最大,其变化程度为-40.06 mV。化合物引起的通道半数激活电压V1/2的变化值具有浓度依赖性,随着浓度的增加,左移程度也增大。（3）不同激活电压下（-40 mV～+30 mV） KCNQ2/3电流的激活时间常数（Tauact）在给药前后均表现出电压依赖性,随着激活电压的增大,激活时间常数缩短,通道开放速率加快。在-40 mV～+30 mV范围内,QO-26、QO-28和QO-41与对照（不给药）相比能明显增大通道的激活时间常数,使通道激活速率减慢,且激活时间常数随化合物浓度的增加而增大（-30 mV激活）。QO-40对通道的激活动力学无明显影响。在-30mV及更负电压下阳性对照药retigabine使通道的激活速率加快,且激活时间常数随化合物浓度的增加而减小。（4）不同电压水平下（-140 mV～-20mV）KCNQ2/3通道的去活时间常数（Taudeact）在对照情况下（不给药）表现出电压依赖性,随着去活电压向超极化方向变化,去活时间常数减小,通道去活速率加快。与对照相比,四种化合物及retigabine均使KCNQ2/3通道的去活动力学过程减慢。（5）与单独给药相比,同时给予最大浓度的吡唑并嘧啶酮类化合物与retigabine的混合物,可产生复合效应,即在阈电位水平至+60 mV电压范围内,相对于单独给药,稳态激活电流均明显增大,阈电位水平向超极化方向移动。（6）分析通道在+60 mV下的激活动力学时程和-120 mV下的去活动力学时程,结果提示,与单独给药相比,给予吡唑并嘧啶酮类化合物与retigabine的混合物能明显延长通道的去活时程,使通道去活减慢。此外,QO-28与retigabine的混合物比单独作用时,明显延长通道的激活时程,使通道激活减慢。（7）在阈电位至+20 mV范围内,给予200μM QO-28,使突变体通道KCNQ2（W236L）的稳态激活电流幅度增大,而retigabine无明显影响。200μM QO-28仍然能够使KCNQ2（W236L）通道的稳态激活曲线向超极化方向移动,而retigabine无明显影响；KCNQ2（W236L）通道在对照、给予200μM QO-28和30μM retigabine三种情况下的半数激活电压（V1/2）分别为-9.0±1.7 mV,-38.5±1.0 mV和-3.2±2.2 mV。结论：（1）在KCNQ2/3激活的阈电位至+60 mV电压范围内,吡唑并嘧啶酮类化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能使KCNQ2/3稳态激活电流幅度增大,并使阈电位水平向超极化方向移动。（2）吡唑并嘧啶酮类化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能明显使KCNQ2/3通道的激活曲线向超极化方向移动（左移）,且具有浓度依赖性。与阳性对照药retigabine加速KCNQ2/3通道的激活过程不同,QO-26、QO-28和QO-41明显减慢通道的激活过程,而QO-40对通道激活动力学无影响。QO-26、QO-28、QO-40、QO-41和RTG均能明显减慢通道的去活动力学过程。激活时间常数和去活时间常数均具有电压依赖性和浓度依赖性。吡唑并嘧啶酮类化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41可能主要通过使稳态激活电流幅度增大、激活曲线左移和减慢去活时程等方面而增强KCNQ2/3通道功能。（3）应用联合给药方法产生的复合效应和测定化合物对突变体KCNQ2（W236L）通道的作用结果提示,吡唑并嘧啶酮类化合物调节KCNQ2/3通道的机制可能不同于retigabine。结论1 Western blot和电生理实验表明KCNQ2和KCNQ3共表达于CHO细胞中,通道电流的电生理学特征及药理学特性均符合KCNQ2/3电流特征,说明KCNQ2/3稳定表达于CHO细胞中,该细胞系可用于后续实验研究。2吡唑并嘧啶酮类化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能增大表达于CHO细胞中的KCNQ2/3电流。其中QO-28的效能最强,其对KCNQ2/3通道的作用程度与阳性对照药retigabine相当；QO-41的效价最高,但弱于阳性对照药retigabine。以QO-41为代表的吡唑并嘧啶酮类化合物也能浓度依赖性地增大大鼠小直径背根神经元上的M电流。通过对一系列毗唑并嘧啶酮类化合物的构效关系研究表明,以吡唑并嘧啶酮为母核的化合物,其2位上的吸电子基团三氟甲基（CF3）,3位上的芳香基团苯环或萘环以及5位上的吸电子基团一氯甲基（CH2Cl）或三氟甲基（CF3）是维持化合物活性所必须的基团,且三氟甲基的活性强于氯甲基,说明5位取代基团吸电子能力越强,其化合物活性也越好。3对KCNQ2/3通道的激活和去活动力学的进一步分析研究表明,在KCNQ2/3激活的阈电位至+60 mV电压范围内,吡唑并嘧啶酮类化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能使稳态激活电流幅度增大,并使阈电位水平向超极化方向移动。吡唑并嘧啶酮类化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41均能明显使通道的激活曲线向超极化方向移动（左移）。与阳性对照药retigabine加速通道的激活过程不同,QO-26、QO-28和QO-41明显减慢通道的激活过程,而QO-40对通道激活动力学无影响。QO-26、QO-28、QO-40、QO-41和retigabine均能明显减慢通道的去活动力学过程。吡唑并嘧啶酮类化合物QO-26、QO-28、QO-40和QO-41可能主要通过使稳态激活电流幅度增大、激活曲线左移和减慢去活时程等方面而增强KCNQ2/3通道功能。4应用联合给药方法产生的复合效应和测定化合物对突变体KCNQ2（W236L）通道的作用结果提示,吡唑并嘧啶酮类化合物调节KCNQ2/3通道的机制可能不同于retigabine。