中国荷斯坦奶牛SRY基因HMG盒原核表达载体构建及表达

论文摘要

奶牛是经济价值较高的动物,实现对奶牛的性别控制,可以在相当大的程度上节约生产成本,提高经济效益。中国荷斯坦奶牛是我国的培育品种,将其作为研究对象更具有现实意义,并且对其性别决定机制的深入研究不仅有助于人们对奶牛性别控制的理论和实践的认识,而且很有可能提出奶牛性别鉴定新的方法。性别控制是一项能显著提高畜牧业经济效益的生物工程技术,对家畜育种、繁殖、生产和遗传疾病的防治均有非常重要的意义。一个世纪以来,性别形成机理的研究已由形态学水平发展到分子水平,哺乳动物的性别决定依赖于Y染色体上的SRY基因（sex-determining region of Y gene）,它使原始性腺发育成为睾丸。众多研究表明:SRY基因突变引起人或其它哺乳动物性腺发育受阻。另外,通过对一些性反转病例的研究发现,性别决定是一个多基因级联调控的过程。性别控制的方法也随性别决定理论研究的深入得到同步发展,从个体水平、细胞水平发展到分子水平,为性别控制研究提供了理论依据和先进技术手段。SRY基因位于Y染色体上靠近拟常染色质区一个35 kb的区域,在进化上高度保守,该基因所编码蛋白中有一段含有70个氨基酸残基的序列具有DNA结合蛋白的特征,被命名为HMG box（High Mobility Group,HMG）。HMG box是SRY蛋白的保守区,由约80个氨基酸组成,存在于许多DNA结合蛋白中。几乎所有的哺乳动物中,均含有SRY蛋白,而其中均含有一个HMG box。到目前为止,引起性反转的所有SRY基因突变位点几乎全位于HMG box序列内。这说明SRY基因是性别决定的核心基因,直接诱导精巢发育,对睾丸发育起着关键性的作用。本研究是利用基因工程技术对SRY基因HMG box的核心序列进行克隆和表达,不仅对牛SRY基因的分子结构特点进行深入研究,而且能够在体外对牛SRY融合蛋白的功能进行分析,进一步了解SRY基因的作用机制,为性别决定机制的阐明奠定坚实的基础。本研究进行了一下几方面工作:（1）抽取雄性荷斯坦奶牛血液,参考分子克隆技术从血液中提取RNA,利用一步法RT-PCR技术扩增出SRY基因的cDNA序列,根据GeneBank收录的奶牛SRY基因序列,设计了一对使扩增产物包括SRY基因编码区的引物（因SRY基因为单外显子基因,其编码区可直接用以基因组DNA为模板的PCR反应获得）,将扩增产物连接至pMD18-T载体,送至生物公司进行序列分析。结果显示,已经获得了中国荷斯坦牛SRY基因的编码区全长,基因编码区与GeneBank收录的奶牛SRY基因同源性达到99.5%。（2）根据牛SRY基因编码区和pET-28a（+）载体设计一对分别带有酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ的引物,以构建好的pMD18-T/SRY载体为模板继续扩增SRY基因编码区,使SRY基因编码区两端带上酶切位点;将获得的PCR产物和pET-28a（+）载体同时进行XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切,并用T4 DNA连接酶连接两种酶切产物,构建表达载体pET-28a/SRY;将表达载体转化至E.coli BL21（DE3）,用IPTG对含有pET-28a/SRY表达载体的E.coliBL21（DE3）进行诱导,使其表达目的蛋白SRY,对表达结果进行SDS-PAGE电泳检测,发现在28 kDa处出现一条浓度较大的条带,表明目的蛋白获得表达。本实验利用现代分子生物技术对SRY基因进行了原核表达,获得了完整的SRY蛋白并对其进行了纯化和鉴定。实验所得的各种数据,为以后的真核表达、抗性分析以及诊断试剂的研制提供了具有参考价值的数据,并为今后SRY蛋白的结构和功能研究奠定了重要的物质基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 哺乳动物性别控制机理
• 1.1.1 引言
• 1.1.2 性别决定的生物学机制
• 1.2 SRY基因研究进展
• 1.2.1 引言
• 1.2.2 SRY基因的本质
• 1.2.3 SRY（Sry）发现前关于性别决定因子的研究
• 1.2.4 SRY/Sry 基因的发现和分离
• 1.2.5 SRY/Sry基因的定位
• 1.2.6 SRY的结构和功能
• 1.2.7 SRY的表达研究
• 1.2.8 SRY基因的启动子
• 1.2.9 SRY蛋白的功能区
• 1.2.10 SRY基因调控模式
• 1.2.11 性别决定相关基因
• 1.2.12 影响性别决定的其他基因及其与SRY/Sry的关系
• 1.2.13 SOX基因家族
• 1.3 研究的目的与意义
• 第二章 中国荷斯坦奶牛SRY基因HMG盒的克隆
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 荷斯坦奶牛总RNA提取结果
• 2.3.2 荷斯坦奶牛总RNA RT-PCR扩增结果
• 2.3.3 重组质粒鉴定
• 2.3.4 测序结果及序列分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 DNA聚合酶的选择
• 2.4.2 关于基因的克隆
• 2.4.3 目的基因的序列分析
• 第三章 中国荷斯坦奶牛SRY基因HMG box的原核表达与SDS-PGAE分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果
• 3.3.1 原核重组表达质粒的构建
• 3.3.2 阳性重组表达质粒的鉴定
• 3.3.3 SDS-PAGE 分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 表达系统的选择
• 3.4.2 目的基因的表达
• 3.4.3 目的蛋白的纯化
• 结论
• 参考文献
• 缩略语表
• 致谢
• 作者简介