活动性结核病血清标志物的鉴定及诊断模型的建立

论文摘要

目的:应用蛋白质谱技术研究活动性肺结核病患者的血清诊断标志物,建立诊断模型早期诊断活动性肺结核;了解潜在标志物的特性及其在肺外结核病血清中的表达情况。方法:应用表面加强激光解吸电离飞行时间质谱技术（SELDI/TOF-MS）和蛋白芯片技术检测下列346例人血清:129例活动性肺结核患者、69例其他呼吸疾病患者、57例结核性胸膜炎患者、4例非结核性胸膜炎患者、19例结核脑膜炎患者、2例非结核脑膜炎患者和66例正常人血清;应用Ciphergen蛋白芯片3.1.1软件比较、分析血清蛋白峰,筛选疾病相关生物标志物;应用Biomarker Pattern 5.0软件建立活动性肺结核的诊断模型。通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化潜在的生物标志物蛋白,应用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF-MS）分析分离所得的蛋白组分,跟踪目标蛋白,目标蛋白的酶解产物进一步用线性液质联用离子肼串联质谱技术（LC-MS/MS）进行分析,以鉴定潜在诊断标志物蛋白的性质,并SELDI/TOF-MS和蛋白芯片技术进一步分析该诊断标志物在肺外结核病的表达量。结果:（1）129例活动性肺结核血清和135例对照血清蛋白指纹图谱比较,有50个差异蛋白峰（p＜0.01）。以69例其他呼吸疾病血清和66例健康人血清为对照,选择5个蛋白峰（4360、3311、8160、5723、15173 m/z）建立诊断模型1,该模型诊断活动性肺结核的灵敏度为82.95%,特异性为89.63%,准确率为86.36%。以69例其他呼吸疾病血清为对照,选择3个蛋白峰（5643、4486、4360 m/z）建立诊断模型2,该模型诊断活动性肺结核的灵敏度为96.9%,特异性为97.8%,准确率为97.3%。（2）质荷比峰为5643 m/z的蛋白为相对高丰度差异表达蛋白,它在62.8%（81/129）的活动性肺结核患者血清中表达显著增高,在71.9%（97/135）的非结核呼吸疾病患者和健康人血清中表达显著降低。因此,选择5643 m/z蛋白作为潜在的诊断标志物,经RP-HPLC分离、纯化,并利用MALDI-TOF-MS及LC-MS/MS进行鉴定,5643 m/z目标蛋白质是粘蛋白,又称为α-1-酸性糖蛋白。57例结核性胸膜炎患者血清和70例对照血清蛋白指纹图谱比较,有52个差异蛋白峰（p＜0.01）。（3）只有47.4%（27/57例）的结核性胸膜炎患者血清中5643M/Z蛋白表达增高;4例非结核性胸膜炎患者血清中5643M/Z蛋白表达均减少。（4）19例结核性脑膜炎患者血清和68例对照血清蛋白指纹图谱比较,有25个差异蛋白峰（p＜0.05）。73.7%（14/19例）的结核性脑膜炎患者血清中5643M/Z蛋白表达增高;2例原发性脑膜炎患者血清中5643M/Z蛋白表达均减少。结论:（1）蛋白质谱技术标本用量少,可直接快速地检测血清标本,可能成为一种新的结核病诊断方法,通过建立结核病质谱诊断平台服务于临床。（2）通过蛋白质组学技术可有效地筛选、分离、纯化、鉴定结核病特异性标志物。（3）结核特异糖形粘蛋白的表达或粘蛋白糖基化差异分析可能成为一个新的诊断方法用于活动性结核病的诊断和鉴别诊断,为研制新型诊断试剂奠定基础.

论文目录

• 缩略词一览表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 活动性肺结核病血清标志物的鉴定及诊断模型的建立
• 1.材料与方法
• 1.1 血清来源及病例分组
• 1.2 血清样品的采集与保存
• 1.3 试剂配制
• 1.4 主要仪器
• 1.5 血清的质谱分析和数据的采集
• 1.6 统计学分析和差异蛋白的筛选
• 1.7 诊断模型的建立
• 1.8 诊断模型的验证
• 1.9 评价指标
• 2.结果
• 2.1 血清蛋白质谱图
• 2.2 健康对照组、非结核疾病对照组、肺结核病组血清蛋白质谱数据的分析、比较
• 2.3 活动性肺结核诊断模型的建立
• 2.4 诊断模型的验证
• 第二部分 潜在蛋白质生物标志物的分离、纯化和鉴定
• 1.材料与方法
• 1.1 主要仪器
• 1.2 血清样品的预处理
• 1.3 潜在生物标志物蛋白的 HPLC 分离纯化
• 1.4 HPLC 分离所得蛋白组分的 MALDI-TOF-MS 检测
• 1.5 目标蛋白质的 LC-MS/MS 分析
• 2.结果
• 2.1 目标蛋白质的 HPLC 分离、纯化
• 2.2 HPLC 组分的 MALDI-TOF-MS 检测
• 2.3 5643m/z 目标蛋白质的鉴定
• 第三部分 5643m/z 蛋白峰在肺外结核病血清中的表达
• 1.材料与方法
• 1.1 血清来源及病例分组
• 1.2 血清样品的采集与保存
• 1.3 血清的质谱分析和数据的采集
• 1.4 统计学分析和差异蛋白的筛选
• 1.5 5643M/Z 蛋白峰表达量分析
• 2.结果
• 2.1 血清蛋白质谱图
• 2.2 健康对照组、非结核性胸膜炎对照组、结核性胸膜炎组血清蛋白质谱数据的分析、比较
• 2.3 健康对照组、非结核性脑膜炎对照组、结核性脑膜炎组血清蛋白质谱数据的分析、比较
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 文献综述
• 参考文献
• 攻读博士期间发表文章情况
• 致谢