减毒伤寒沙门氏菌作为表面展示疫苗载体的应用研究

论文摘要

重组活菌载体疫苗是将外源抗原基因插入活菌载体的染色体或质粒中,激发免疫系统提呈该外源抗原并产生有效免疫保护,进而达到预防一种或多种疾病的目的。减毒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhi, S. Typhi）因具有特殊的优点而成为疫苗研究的热点,被广泛应用于病毒和细菌等疫苗的研制,并且显示出良好的应用前景。在小鼠模型实验中证明,使用减毒沙门氏菌株携带幽门螺旋杆菌保护性抗原尿素酶,可以有效将抗原提呈给免疫系统。在减毒伤寒沙门氏菌研究方面已经取得了相当大的进展,它既可以作为一个更有效的伤寒沙门氏菌疫苗,又可以表达异源抗原。其中最广泛评估的减毒伤寒沙门菌疫苗候选株是CVD908 （Ty2 aroC aroD）以及CVD908-htrA （Ty2 aroC aroD htrA）。一,利用λRed体内重组系统,以CVD908为出发菌株,敲除其染色体上的asd基因,以期构建质粒-宿主平衡致死系统,以便稳定地表达外源抗原。用其基因组为模板,扩增得到asd基因的上下游同源臂,通过酶切连接等方法,将上下游同源臂连接在打靶载体的卡那霉素抗性基因的两侧,以该载体为模板扩增得到高浓度线性打靶片段。将含λRed体内重组系统的质粒pKD46电击转化入CVD908,诱导重组系统表达后,再将打靶片段转化进去,用含卡那霉素平板筛选出阳性转化子。使用质粒pCP20去除卡纳霉素抗性基因,从而得到CVD908的asd基因敲除株。使用与敲除asd基因相同的方法,在CVD908 （Ty2 aroC aroD asd）基础上敲除了其毒力基因htrA,对其进行进一步的减毒,并通过PCR和RT-PCR等方法分别在DNA水平和RNA水平进行了上述基因敲除的验证。二,在平衡致死系统的基础上,构建表面展示载体,并对展示效果进行评价。敲除CVD908的asd基因后,菌株出现营养缺陷表型,然后用大肠杆菌（Escherichia coli）的asd基因进行互补。在原始质粒pBAD-△ssdsbc的基础上,用大肠杆菌的asd基因替换质粒上的氯霉素抗性基因,构建平衡致死质粒。在质粒的阿拉伯糖启动子后面插入表面展示工具及幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）尿素酶（ureB）基因编码区序列,从而得到表面展示载体。然后将该载体电击转化入减毒沙门氏菌CVD908-htrA （Ty2 aroC aroD asd htrA）,得到活菌疫苗株CVD908-htrA-LOU。利用UreB的单抗对疫苗株进行流式细胞计数分析、全菌蛋白和外膜蛋白提取结合免疫印迹分析以及间接免疫荧光观察分析,都证实UreB蛋白成功展示于菌体表面。三,对得到的重组菌进行安全性评价。通过细菌侵染小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7和人宫颈癌上皮细胞Hela细胞,进行侵袭力以及24h胞内增殖力实验,表明CVD908-htrA-LOU较CVD908和野生株Ty2的侵袭力和在胞内生存力显著减弱。此外又进行了小鼠半数致死量的实验,也表明CVD908-htrA对小鼠的LD50较野生株Ty2提高了三个数量级,较出发株CVD908也提高了一个数量级,充分说明新构建的重组菌CVD908-htrA-LOU安全性较野生株Ty2和出发株CVD908有明显提高。四,将表面展示尿素酶B亚单位的活菌疫苗直接口服免疫BalB/C小鼠,进行动物体内免疫效果的评价。共设四个免疫组,第一组为生理盐水组；第二组为空载体组（CVD908-htrA-LO）;第三组为尿素酶表面展示组（CVD908-htrA-LOU）;第四组为尿素酶胞内表达组（CVD908-htrA-U）。两次口服免疫之后,检测血清中尿素酶特异性IgG抗体水平,结果发现,CVD908-htrA-LOU组激发产生的尿素酶特异性IgG抗体水平高于CVD908htrA-U组,尽管后者表达的尿素酶B的表达水平远远高于CVD908-htrA-LOU组。实验说明,从外源抗原的递送形式而言,活菌载体表面展示外源抗原,其免疫效果可能更优于同样的活菌载体在胞内表达外源抗原。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 文献综述
• 1 幽门螺杆菌研究进展
• 1.1 形态学特征
• 1.2 H.pylori感染与宿主免疫反应
• 1.3 流行病学
• 1.4 H.pylori感染与胃肠道相关疾病
• 1.4.1 H.pylori感染与慢性胃炎
• 1.4.2 H.pylori感染与消化性溃疡
• 1.4.3 H.pylori与胃MALT淋巴瘤
• 1.4.4 H.pylori感染与胃癌
• 2 尿素酶研究进展
• 2.1 尿素酶的生物学结构
• 2.2 尿素酶的致病机制
• 2.2.1 对宿主的损伤
• 2.2.2 辅助定植
• 2.3 尿素酶相关疫苗的研制
• 3 伤寒沙门氏菌研究进展
• 3.1 减毒沙门氏菌载体的优点
• 3.2 减毒沙门氏菌作为幽门螺杆菌疫苗载体的应用研究
• 4 λRed体内重组系统的应用
• 4.1 λRed体内重组系统的原理
• 4.2 λRed体内重组系统的组成
• 5 细菌表面展示系统的应用
• 第一章 减毒沙门氏菌CVD908基因缺失突变株的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒（表1-1）
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 酶与试剂
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物
• 1.2.2 PCR扩增目的基因方法
• 1.2.3 构建打靶载体
• 1.2.4 感受态细胞的制备和电击转化
• 1.2.5 敲除asd基因
• 1.2.6 去除卡那霉素抗性基因
• 1.2.7 asd敲除株的RT-PCR分析
• 1.2.8 敲除CVD908Δasd的htrA基因
• 2 结果
• 2.1 构建打靶片段两边同源臂
• 2.1.1 PCR扩增目的基因两侧同源臂
• 2.1.2 鉴定打靶载体
• 2.1.3 打靶线性DNA的获得
• 2.2 敲除asd基因及PCR鉴定
• 2.3 去除卡那霉素抗性基因及验证
• 2.4 在RNA水平上鉴定asd敲除
• 2.5 敲除htrA基因以及PCR、RT-PCR鉴定
• 2.6 asd基因敲除导致了营养缺陷
• 3 讨论
• 第二章 表面展示系统的建立及展示效果评价
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒和菌株（表2-1）
• 1.1.2 酶与试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.1.4 主要仪器
• 1.1.5 溶液
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物
• 1.2.2 PCR扩增目的基因
• 1.2.3 感受态细胞的制备
• 1.2.4 电击转化
• 1.2.5 平衡致死及表面展示系统的构建
• 1.2.6 重组菌全菌蛋白分析
• 1.2.7 外膜蛋白的提取
• 1.2.8 重组蛋白的免疫印迹分析（Western blot）
• 1.2.9 重组菌流式细胞计数分析及间接免疫荧光观察
• 1.2.10 通过全菌ELISA的方法检测UreB表达于菌体表面
• 2 结果
• 2.1 平衡致死及表面展示系统的构建示意图
• 2.2 全菌蛋白分析证明融合蛋白能够表达
• 2.3 全菌ELISA证明融合蛋白能够展示
• 2.4 免疫印迹分析证明融合蛋白能够表达
• 2.5 荧光显微镜观察证明融合蛋白能够展示
• 2.6 流式细胞计数分析证明融合蛋白能够展示
• 3 讨论
• 第三章 安全性评价及免疫评价
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细菌
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 细胞株及动物
• 1.1.4 用到的仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 减毒株侵染细胞及在胞内增殖力试验
• 50实验'>1.2.2 减毒株感染小鼠的LD₅₀实验
• 1.2.3 动物免疫
• 1.2.4 血清制备
• 1.2.5 抗体测定
• 2 结果
• 2.1 重组减毒株对细胞侵袭力减弱
• 2.2 重组减毒株在细胞内增殖力降低
• 50明显提高'>2.3 减毒株感染小鼠的LD₅₀明显提高
• 2.4 疫苗株在小鼠体内的免疫效果评价
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历