可逆性组蛋白乙酰化修饰在人WT1基因转录调控中的作用及其分子机制研究

论文题目: 可逆性组蛋白乙酰化修饰在人WT1基因转录调控中的作用及其分子机制研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 细胞生物学

作者: 邵阳光

导师: 黄百渠

关键词: 组蛋白乙酰转移酶,组蛋白去乙酰化酶,转录辅激活子,转录因子

文献来源: 东北师范大学

发表年度: 2005

论文摘要: 组蛋白的翻译后修饰所引起的染色质结构的重塑在真核生物基因表达调控中发挥着重要的作用。其中研究得最深入的是由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)催化的乙酰化反应。这两种酶通过对核心组蛋白尾部赖氨酸残基进行可逆的乙酰化修饰来调控转录的起始,并由此介导基因的激活或抑制。转录辅激活子p300/CBP 和 P/CAF 是具有组蛋白乙酰转移酶活性的蛋白,能通过多种机制参与许多基因的转录调控过程。 WT1 基因编码一种锌指结构的蛋白 WT1。WT1 蛋白在调控生长和分化方面起重要作用,主要参与肾和生殖腺的发育过程,另外在造血系统的早期发育过程中也起作用。WT1基因的改变除了能引起维耳姆斯氏瘤(Wilms’tumor)之外,还与几种发育异常综合征和白血病、间皮瘤、生殖腺肿瘤等其它肿瘤有关。因此,阐明 WT1 基因的转录调控机制不仅对胚胎发育的研究有意义,而且将为治疗 WT1 相关疾病奠定理论基础。本论文旨在确定可逆的组蛋白乙酰化修饰是否参与WT1基因的转录调控,并试图探讨其分子机制。通过一系列瞬时转染和相对荧光素酶活性分析以及RT-PCR实验,我们发现组蛋白乙酰转移酶p300/CBP不仅能促进WT1启动子和内部增强子的活性,而且能提高内源WT1 mRNA的表达水平。E1A蛋白能抑制p300对WT1报告基因转录激活的促进作用,而其突变体E1A delta 2-36因不能与p300/CBP结合而没有这种作用,这也间接地证明了p300/CBP能促进WT1基因的表达。我们的结果还表明p300/CBP可分别与转录因子Sp1、c-Myb和Ets-1协同地促进WT1报告基因的转录活性。通过WT1内部增强子克隆方向不同的质粒,我们证明p300/CBP促进WT1报告基因的转录激活不受内部增强子方向的影响。此外,通过采用HAT区缺失突变的p300表达质粒的转染实验,我们证明了p300/CBP的组蛋白乙酰转移酶活性在WT1基因转录调控过程中发挥重要作用。通过染色质免疫沉淀实验(ChIP),我们发现p300/CBP能够提高WT1内部增强子处组蛋白H3的乙酰化水平。另外,我们的结果表明另一种组蛋白乙酰转移酶P/CAF不仅能促进WT1报告基因的表达,而且在此过程中与p300/CBP具有协同作用。在它们协同地促进WT1报告基因表达的过程中,p300/CBP和P/CAF的HAT活性都非常重要。另一方面,我们验证了六种人组蛋白去乙酰化酶(HDAC1-6)对WT1报告基因表达水平的影响。结果表明,HDAC4和HDAC5不仅能抑制WT1报告基因的活性,而且能下调内源WT1 mRNA的表达水平。在瞬时转染和报告基因活性分析中,HDAC4和HDAC5能抑制p300对WT1报告基因转录激活的促进作用。本论文的结果首次揭示了组蛋白可逆的乙酰化修饰参与WT1基因的转录调控,并对其分子机制进行了初步的探讨,为深入研究WT1基因转录调控机制和WT1相关疾病的研究奠定了基础。

论文目录:

中文摘要

英文摘要

引言

一、本论文的研究背景和立题依据

（一） WT1 简介及研究背景

（二）立题依据

二、本论文的研究内容和意义

第一章文献综述

一、染色质重塑与转录调控

（一）核小体结构和转录

（二）组蛋白修饰酶类重塑复合物

（三）依赖 ATP 的重塑复合物

二、组蛋白密码假说

（一）表观遗传密码

（二）组蛋白修饰的动力学

（三）组蛋白密码的建立

（四）组蛋白翻译后修饰与染色质的转录状态

（五）组蛋白密码的阅读

（六）利用组蛋白密码：新的治疗途径

三、组蛋白乙酰转移酶

（一）组蛋白乙酰转移酶的分类

（二）组蛋白乙酰转移酶及其复合物的生物学功能

四、组蛋白去乙酰化酶

（一）组蛋白去乙酰化酶的分类

（二）组蛋白去乙酰化酶的生物学功能

（三） HDAC 抑制剂和sirtuins 家族的小分子抑制剂

五、组蛋白乙酰转移酶p300/CBP的结构和功能

（一） p300/CBP 的结构

（二） p300/CBP 的作用机制

（三） p300/CBP 活性的调控

（四） p300/CBP 在细胞增殖、分化和凋亡中的作用

（五） p300/CBP 与癌症

（六） p300/CBP 与神经退行性疾病

（七） p300/CBP 在白细胞介素基因表达调控中的作用

六、WT1 的生物学功能

（一） WT1 在正常及异常发育中的作用

（二） WT1 与其它恶性肿瘤

第二章实验材料和方法

一、实验材料

（一）细胞

（二）主要试剂

二、实验方法

（一） HeLa 细胞基因组DNA 提取

（二）分子克隆

（三）质粒大量制备的方法

（四）哺乳动物细胞培养

（五）哺乳动物细胞转染及相对荧光素酶活性测定

（六）哺乳动物细胞总RNA 的提取

（七）逆转录PCR (RT-PCR)

（八）染色质免疫沉淀实验（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）

第三章实验结果与分析

一、重组质粒的构建及鉴定

（一） WT1 报告基因质粒的构建及鉴定

（二）缺失突变质粒的构建及鉴定

二、组蛋白乙酰转移酶p300/CBP 在WT1 基因转录调控中的作用

（一）检测时间的确定

（二） p300/CBP 参与了WT1 基因的转录激活

（三） p300/CBP 参与WT1 基因转录激活的机制

三、组蛋白乙酰转移酶P/CAF 在WT1 基因转录调控中的作用

（一）组蛋白乙酰转移酶P/CAF 参与WT1 基因的表达调控

（二） p300 和P/CAF 能协同促进WT1 基因的表达

（三） p300/CBP 和P/CAF 的协同作用增强了c-Myb 介导的WT1 基因的转录

（四） p300 和P/CAF 的HAT 活性在c-Myb 介导的WT1 基因转录激活中都非常重要

四、组蛋白去乙酰化酶在WT1 基因转录调控中的作用

（一）在人HDAC1-6 中，只有HDAC4 和HDAC5 能抑制WT1 启动子荧光素酶报告基因的表达

（二） HDAC4 和HDAC5 以剂量依赖的方式抑制WT1 启动子报告基因的激活

（三） HDAC4 和HDAC5 能抑制p300 对WT1 转录激活的增强作用

（四） HDAC4 和 HDAC5 能抑制p300 和c-Myb 在 WT1 转录激活中的协同作用

（五）过表达的HDAC4 或HDAC5 下调了内源WT1m RNA 的表达水平

第四章讨论

一、组蛋白乙酰转移酶p300/CBP、P/CAF 和组蛋白去乙酰化酶 HDAC4 及 HDAC5 都参与了WT1基因的转录调控

二、转录辅因子和转录因子协同促进WT1 基因的转录激活

三、组蛋白乙酰转移酶p300/CBP 参与WT1 基因表达调控的分子机制

（一）组蛋白乙酰转移酶p300/CBP 的 HAT 活性在 WT1 基因表达调控中起重要作用

（二） p300/CBP 通过乙酰化转录因子从而促进WT1 基因的转录

（三） p300/CBP 作为桥蛋白和支架蛋白发挥作用

四、组蛋白乙酰转移酶p300/CBP 和P/CAF 的协同作用促进了WT1 基因的转录

五、组蛋白可逆的乙酰化修饰参与了WT1 基因的转录调控过程

六、WT1 基因表达调控的简单模型

结论和创新点

参考文献

附录

后记

在学期间公开发表论文及著作情况

发布时间: 2005-07-07

参考文献

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可逆性组蛋白乙酰化修饰在人WT1基因转录调控中的作用及其分子机制研究

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