论文摘要
自1963年Starzl完成第一例人体原位肝移植以来，经过40余年的发展全世界已经步入了肝移植时代。虽然肝移植的手术成功率已超过90％，但移植术后的各种并发症仍然是阻碍移植肝存活率和受体生存率进一步提高的主要原因。其中胆道并发症是肝移植术后最常见的并发症之一，其发生率高达9％—30％，而且处理困难，严重影响了病人的生存率和生活质量。且随着移植技术、围手术期处理的逐步完善，其他并发症的发生率已明显下降，而胆道并发症的发生率仍然居高不下。根据研究发现，胆道重建方式、缺血再灌注损伤、免疫排斥反应、感染等因素是导致移植肝胆道形态结构改变和功能损害的主要原因。研究胆道并发症的原因、发病机制和处理措施以降低其发生率，对改善患者的生存率和生活质量具有重要意义。第一部分大鼠自体原位肝移植胆道缺血再灌注损伤模型的建立及意义目的：临床肝移植的每一次技术进步都离不开与之相关的基础研究。基础研究的发展大多是建立在动物实验基础之上的，从而再用于临床。故理想的动物模型是进行肝移植实验研究的基础。大鼠肝移植是目前应用最广泛同时也是最为成熟的动物模型，模型成功率和稳定性对基础研究有着直接的影响。Kamada提出的“双套袖法”大鼠动物模型是目前国内外通用的方案，但此模型不吻合肝动脉，故用来作胆道损伤方面的研究显得不足，而吻合肝动脉的模型难度更大。且就以往的研究表明除手术技术所致的胆道血供受损的原因外，缺血再灌注损伤是肝移植术后胆道并发症的主要原因。所以建立方法简单、成功率高、重复性好的动物模型，用以研究胆道缺血再灌注损伤的病理生理过程很有必要。材料与方法：SPF级纯系SD大鼠102，肝脏游离后使之肝素化，使用4℃含肝素(12.5U／ml)的乳酸林格氏液经门静脉、腹主动脉双重恒压灌注，除血管吻合外，其余方法同大鼠原位肝移植。且门静脉(PV)、肝动脉(HA)再灌注由血管夹控制。结果：本模型手术成功率95.6％(97／102)，热、冷缺血和再灌注时间可精确控制，无肝期16.17±0.92min。双重恒压灌注效果好，光镜下胆道壁毛细血管未见红细胞。第二部分相对热缺血对肝外胆道损伤的实验研究目的：缺血再灌注损伤是移植肝胆管必须经历的病理生理过程，这也是导致胆道并发症的主要原因之一。移植肝胆管要经历短暂的热缺血、冷保存损伤、复温性损伤、门静脉开放到肝动脉开放(相对热缺血)损伤、再灌注损伤。目前对热缺血、冷保存的损伤研究较为透彻。而门静脉开放到肝动脉开放时间是移植肝胆道热缺血的一种特殊形式，又称之为“移植肝胆道相对热缺血时间”或“肝动脉缺血时间”，这一时间的长短与术后胆道并发症的发生密切相关，进行此方面研究以确定相对热缺血的安全时限具有重要意义。胆道不同部位之间的组织结构、功能及血供配布不同，从而缺血再灌注损伤亦有差别，在胆道端端吻合已成胆道重建标准的今天，研究移植肝肝外胆道不同部位损伤的差异，从而确定移植肝胆道吻合部位具有一定的临床价值。材料与方法：1、实验动物分组和标本采集健康、成年、SPF级纯系SD大鼠102只，随机分成五组，Ⅰ组为假手术组：Ⅱ组，PV、HA同时开放组；Ⅲ组，PV开放30min后HA开放组；Ⅳ组，PV开放1h后HA开放组；PV开放2h后HA开放组。Ⅱ～Ⅴ组在肝动脉开放后1h和2h两个时间点留取标本。2、观察指标：肝外胆管细胞凋亡检测—TUNEL法及肝外胆道病理形态学。3、评估方法：细胞凋亡计数：每张切片高倍光学显微镜下(×400)随机选取10个视野，计算细胞总数和凋亡细胞总数，以凋亡细胞总数／细胞总数计算出凋亡细胞百分率，作为凋亡指数(AI)。病理形态学量化分级：参照Hertl等人的方法并根据本实验结果加以改进，对肝外胆管损伤程度进行分级，0级：胆管粘膜上皮细胞和粘膜下腺体上皮细胞正常(记0分)；1级：损伤局限在粘膜上皮层，胆管粘膜上皮细胞有散在性固缩、坏死、脱落，其数量不足粘膜上皮细胞总数的10％，粘膜下腺体正常(记1分)；2级：10％—30％的胆管粘膜上皮细胞固缩、坏死、脱落，10％以下的粘膜下腺体上皮细胞变性、坏死、脱落(记2分)；3级：超过30％的胆管粘膜上皮细胞坏死、脱落，10％—30％的粘膜下腺体上皮细胞变性、坏死、脱落(记3分)。4、统计分析：研究结果均以均数加减标准差((?)±s)表示，使用统计学软件SPSS13.0进行统计学分析，多组均数间比较采用析因设计的方差分析结果：1、Ⅱ～Ⅴ组随着相对热缺血时间的延长，病理形态学评分及胆管上皮细胞凋亡等损伤指标和Ⅰ组比较(以胆总管近端为例)都有统计学意义(P=0.00)。每组在1h和2h两个时间点上的比较也有统计学意义(P=0.00)，即Ⅱa～Ⅴa组间、Ⅱb～Ⅴb组间两两比较有显著性差异。各组在HA再灌注1h和2h两个时间点的组间两两比较都有统计学意义(P＜0.05)，即Ⅱa与Ⅱb组间、Ⅲa与Ⅲb组间、Ⅳa与Ⅳb组间、Ⅴa与Ⅴb组间有显著性差异，其中，相对热缺血2h组(Ⅴ组)胆管上皮损伤最重，再灌注1h和2h相比，再灌注2h后损伤较重。2、肝外胆道不同部位比较，在Ⅱ～Ⅳ组，胆总管近端和远端的比较虽然无统计学意义(P＞0.05)，但从数据情况看，十二指肠近端损伤最轻，且分别与肝门部胆管比较有统计学意义(P＜0.05)，即肝门部胆管损伤最重；在Ⅴ组，三个部位的两两比较有统计学意义(P＜0.05)，即肝门部胆管损伤最重，胆总管远端次之，胆总管近端最轻。结论：1、本模型模拟了原位肝移植的全过程，具有良好的重复性、稳定性和易控性，确定了游离顺序并改良了灌注方法，能够直接、客观的观察冷缺血、相对热缺血、再灌注对胆道的损伤作用。此外还可用于门静脉、肝动脉开放次序的研究。2、缺血再灌注对肝外胆管上皮细胞的损伤也表现为细胞凋亡，在热缺血和冷灌注无差别的条件下，相对热缺血时间的延长与肝外胆管上皮细胞凋亡程度呈时间—效应关系，提示肝外胆管上皮细胞细胞凋亡和肝细胞及肝内胆管上皮细胞凋亡一样是缺血再灌注损伤的早期事件。3、从缺血时间分析，胆道损伤的程度与相对热缺血时间呈正相关，随着缺血时间的延长损伤逐渐加重，在目前如不能将PV、HA同时再灌注的情况下，尽量缩短相对热缺血时间，最好控制在30min左右，尽量不要超过1h，否则因胆道损伤较重而致术后胆道并发症机率可能增加。4、从部位分析，肝门部胆管损伤最重，胆总管远端次之，胆总管近端最轻，提示临床肝移植中，供肝修整时应注意保护胆管周围组织，避免向肝门方向过多的游离胆管而破坏胆管血供，在行胆管吻合时应避免在肝门部胆管，尽量以胆总管近端作为最佳吻合部位。