论文摘要
新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种重要的条件致病性真菌,主要存在于养鸟场或被鸟类排泄物污染的土壤中,在AIDS和HIV相关隐球菌病病人房子的灰尘和空气中也能够找到新生隐球菌的病原体。它常感染免疫低下或免疫缺陷的患者,从而引起临床症状,甚至危及生命。新生隐球菌不同于人类的其它致病性真菌,它被一种多糖荚膜的动态组织结构包裹着,具有能穿过和存活于哺乳动物免疫系统的特性,会在出芽生殖时经历其基因数量、大小和序列重组的改变。从核酸水平研究新生隐球菌的致病机理和病原学特性,为隐球菌的诊断、治疗和预防提供更加科学的依据。近30年来,不同的实验室建立了多个真核生物分子生物学模型系统,例如啤酒酵母（Saccaromyces Cerevisiae）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、构巢曲霉(Aspergilius nidulan5j等。这些模型系统的建立促进了新生隐球菌分子生物学的发展。目前比较一致的有关隐球菌病的假说是,宿主可能是通过繁殖体的吸入而被感染,如吸入小的荚膜发育不良的酵母或在自然环境中有性繁殖产生的1—2μm的担子孢子。担孢子是隐球菌病的感染繁殖体,但由于对其体外复制和动物感染模型的研究还尚未成熟。尽管表型特征明显的新生隐球菌毒性因子已得到鉴定相关的基因也已克隆,但目前仍有一些可能的毒性因子及其作用未被发现。新生隐球菌ISC10基因是一个新的隐球菌基因产物。ISC10（Meiosis-specific protein required for spore formation）基因是一种孢子形成所必需的蛋白质。1993年,Kobayashi等从酵母中分离和鉴定出ISC2、ISC10两种特异性基因,发现ISC2和ISC10在发生减数分裂作用后,都具有很强的出芽繁殖能力,并且证实ISC10基因的敲除可导致酿酒酵母形成孢子的能力下降。ISC10基因是从酿酒酵母标本中分离出来的,在人工诱导减数分裂7.5小时后产生的,在合成生殖细胞时起到重要作用。ISC10基因能合成稳定磷酸纤维素,具有促成和维护、保养复层鳞状上皮细胞的作用。研究显示巨噬细胞对新生隐球菌的影响,会导致新生隐球菌的基因表达发生一定的改变,本实验室利用酵母基因芯片技术已筛选到新生隐球菌被巨噬细胞吞噬前后特异性表达的基因,ADK1、CYR1基因表达上升,而HSP70、ISC10等基因表达下降。ISC10基因表达下降与新生隐球菌被巨噬细胞吞噬后,新生隐球菌的出芽率的下降有关。为进一步深入研究ISC10基因与新生隐球菌的关系,必须先要克隆到新生隐球菌的ISC10基因。如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因,克隆再表达,试图获取目的蛋白的思路是行不通的,因为获取的DNA里面会含有非编码区。要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白,只能通过提取其mRNA并进行RT—PCR这条颇费周折的途径。RT—PCR（反转录聚合酶链式反应）的原理:是以总RNA或poly（A）+选择性RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起,。逆转录反应可以使用逆转录酶,以随机引物、oligo（dT）或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT—PCR中,每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中,逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下,在一只管中顺次进行。本课题通过RT—PCR技术从新生隐球菌中克隆到与酵母出芽繁殖相关基因ISC10的全长cDNA序列并进行生物信息学分析,构建pGM-T vector重组质粒,在大肠杆菌BL21 pLysS中的活性的表达。为后续研究新生隐球菌ISC10基因的表达调控及其潜在的生物学功能奠定了基础,也为进一步研究新生隐球菌的致病机制、毒性因子及其临床治疗提供了新的研究方向。研究目的:利用反转录聚合酶链式反应,验证抽提得到的新生隐球菌mRNA是否具有多聚苷酸（PolyA）尾现象。通过RT-PCR技术克隆到新生隐球菌酵母出芽繁殖相关基因ISC10的全长cDNA序列并对其核苷酸序列进行分析。表达新生隐球菌ISC10基因,构建pGM—T/ISC10重组质粒,并转化到大肠杆菌感受肽细胞中,研究新生隐球菌ISC10基因表达的活性。研究方法:培养新生隐球菌野生株B3501,经分离、活化后在对数生长期时收集菌体,加入裂解酶成功破除新生隐球菌细胞壁及外层荚膜。采用酵母RNA抽提试剂盒成功提取到新生隐球菌总RNA,分离纯化mRNA,利用RT—PCR方法,反转录合成cDNA模板进行PCR反应。培养新生隐球菌标准株ATCC32609、标准株BLS26、标准株BLS104、D2Y尿素酶阴性株（血清A型）等,在对数生长期时收集菌体。按酵母总RNA提取试剂盒（RNAsimple Total RNA Kit）方法提取新生隐球菌总RNA,经鉴定后按cDNA第一链合成试剂盒（Quantscript RT Kit）方法合成cDNA第一链。依据酿酒酵母ISC10基因的保守区序列设计引物并合成。目的基因的PCR扩增,并将所得PCR反应产物通过琼脂糖凝胶电泳检测,用以进行氨基酸序列和及其生物信息学的分析。将编码新生隐球菌ISC10基因的部分序列,克隆到表达载体pGM-T vector中构建重组质粒,进行IPTG诱导在E.coli BI21（DE3）中表达,表达产物分别经SDS·PAGE进行检测。结果:提取新生隐球菌总RNA样品中28S rRNA亮度都高于18S rRNA说明提取过程中没有降解现象发生,而且在经DNase处理后电泳检测中看不到DNA污染.经紫外分光光度计检测新生隐球菌D260/D280为1.79±0.05,说明RNA的纯度较好。通过polyATtract’mRNA分离系统分离得到的产物,利用琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度法的浓度测定,均未检测到mRNA的存在。以提取总RNA合成的cDNA为模板,P1、P2为引物,在扩增条件、反应体系相同的情况下,多次进行PCR扩增结果与预期的条带大小一致,片段大约782bp,编码267个氨基酸残基,分子量为31.65KD,编码的蛋白质在67位氨基酸由Ala（丙氨酸）突变为Pro（脯氨酸）,233位氨基酸由Thr（苏氨酸）突变为Ser（丝氨酸）。含有1个起始密码子,2个外显子共18个氨基酸序列,C0901656、AW782246、CN581440、T17804为四个表达序列。所克隆的ISC10基因共编码267个氨基酸,分子量为31.65KD,与GenBank中ISC10基因（DQ332212）序列同源性达99.10%。新生隐球菌ISC10基因中46个密码子与LacZ基因（β-半乳糖苷酶）融合作用具有高度的相似性。编码新生隐球菌ISC10基因的序列在大肠杆菌细胞内获得了表达,含有表达载体pGM-T的大肠杆菌BI21（DE3）转化子具有新生隐球菌的细胞活性。结论:新生隐球菌总RNA内无DNA污染;利用随机引物反转录产物为模板进行的PCR产生多条带,表明总RNA己经被反转录（利用随机引物反转录产物的PCR条带中还含有rRNA反转录扩增带）:材料同时用Promega的mRNA纯化系统进行mRNA纯化时,分离系统进行新生隐球菌的mRNA分离时几次均未得到任何产物。通过RT-PCR反应结果证明了新生隐球菌的mRNA不具有Poly（A）尾现象,为后续的基因克隆奠定基础。利用逆转录PCR技术,实现了对新生隐球菌ISC10基因的克隆化及其鉴定,并分析了新生隐球菌ISC10基因的序列.经基因序列比对发现了几种具有高度同源性的菌株和与作为酵母菌中检测启动子LacZ报告基因的作用具有高度相似性。这提示我们可以通过大肠杆菌LacZ报告基因来研究新生隐球菌的基因调控和生物学功能。运用基因重组表达技术,编码新生隐球菌ISC10基因的部分序列,克隆到表达载体pGM-T中,T7启动子的下游,构建pGM—T/ISC10原核表达载体。在大肠杆菌BI21（DE3）中得到表达。说明新生隐球菌ISC10基因的这些cDNA片段可以被单独表达,从而验证ISC10为1个新的新生隐球菌基因,为以后的深入研究打下基础。
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相关论文文献
- [1].新生隐球菌ISC10基因的cDNA克隆及序列分析[J]. 中国皮肤性病学杂志 2008(06)
标签：新生隐球菌论文; 基因论文; 分子克隆论文; 逆转录聚合酶链式反应论文;