RGD交联去细胞牛心包构建组织工程心脏瓣膜支架的实验研究

论文摘要

我国是风湿性心脏病的高发国家,每年至少有10万例患者需要瓣膜置换。现有的人造心脏瓣膜存在着缺陷:机械瓣需终生抗凝,容易发生出血及血栓栓塞并发症;生物瓣由于组织退行性变、钙化而导致瓣膜衰坏和功能障碍。因此,具有生长能力和修复功能的组织工程心脏瓣膜（tissue engineered heart valves, TEHV）成为研究的方向和热点。理想的支架材料是构建具有生物活性功能TEHV至关重要的问题,其应当具有良好的生物力学性能和组织相容性。目前国内外还未有理想的TEHV,主要的一个问题就在于尚没有理想的TEHV支架材料。已有的支架材料存在各自缺陷:合成材料由于机械强度不足,缺乏ECM成份及适合的可降解性等问题,未有成功应用的报道;生物支架保存了较完整的细胞外基质（extra cellular matrix,ECM）成份,同时有良好的机械性能而具有独特优势,但也存在细胞黏附及在支架内部生长困难等问题。如何克服材料固有缺陷,改良出符合TEHV要求的支架,是目前国内外研究的重点。牛心包（bovine pericardium,BP）是一种取材方便,临床应用广泛的生物材料,本课题针对牛心包生物材料,改进处理方法,采用胰酶+TritonX-100法去除牛心包细胞成份,观察了不同去细胞时间对材料组织学、生物力学性能的影响;并采用乙酸（acetic acid,AA）对去细胞牛心包（acellular bovine pericardium,ABP）进一步改良,提高材料孔径及孔隙率,同时首先在生物材料表面共价交联RGD多肽,进一步增加对种子细胞黏附、迁移及增殖的影响;同时体外培养、鉴定人骨髓间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）,并进行RGD多肽对hMSCs生物学功能影响实验;将改良后的ABP支架材料进行体外hMSCs种植实验,进一步对乙酸处理、RGD多肽交联的改良ABP作为TEHV支架材料的可行性进行探讨与研究。第一部分:采用我们研究组过去首先应用的胰酶+TritonX-100,结合DNA酶与RNA酶去细胞方法进行BP去细胞处理,对不同TritonX-100处理时间的去细胞效果,ABP的结构特点、力学性能进行对照研究。结果提示采用胰酶+TritonX-100方法,可以完全脱除牛心包内细胞成份。TritonX-100高、低渗溶液去细胞处理8 h组在完全去除细胞成份的基础上,能保持胶原纤维形态结构和排列,其力学性能较BP有明显下降,但最大拉伸强度（Maximum tensile strength,Tmax）仍保持在12.61±0.64 MPa的较高水平。说明经过适合时间胰酶+TritonX-100去细胞处理得到的ABP支架具有较好的生物相容性及力学强度,符合组织工程瓣支架材料的基本要求。第二部分:采用AA对ABP进一步改良,提高材料孔径及孔隙率,同时我们首先在材料表面共价交联RGD多肽,以期进一步增加对种子细胞黏附、迁移及增殖的影响。结果显示: AA处理ABP材料,使材料的孔陉及孔隙率明显提高（162.2±24.3 um,94.7±1.8%, p<0.01）,相比胶原酶处理,AA处理能在提高材料孔径及孔隙率的基础上保持较好的胶原纤维排列和力学强度（Tmax= 9.93±0.82 MPa）;通过EDC/NHS共价交联RGD多肽,可以在ABP材料表面大量牢固结合RGD多肽。以上实验结果将为种子细胞在支架材料上的黏附、迁移和增殖创造良好的条件。第三部分:分离培养、鉴定hMSCs,并通过胶原膜黏附实验初步观察RGD多肽对hMSCs生物学性能的影响。结果表明:通过通过密度梯度离心法、贴壁筛选法可成功分离出hMSCs;采用10%胎牛血清（fetal calf serum,FCS）/DMEM培养体系对hMSCs体外培养、扩增顺利;流式细胞仪检测3-7代（P3-7）hMSCs表面标志:CD73、CD 105、CD 166、CD90及CD44 （粘附分子,基质细胞表达）为阳性;CD34、CD31及CD45持续阴性,说明本实验培养的细胞具备MSC的表面标记特点,细胞成分均一,纯度在98%以上,具有高度的同源性;体外RGD交联胶原膜,明显增加hMSCs的黏附,加快细胞骨架合成,说明以RGD多肽交联ABP为支架可能大大增强hMSCs的黏附、迁移及增殖。第四部分:将改良后的ABP支架材料进行体外hMSCs种植实验,结果显示:与单纯去细胞处理（ABP）、AA处理（AA）及RGD多肽交联（RGD）的ABP相比,hMSCs黏附数量明显增多,种植10天后在AA处理同时有RGD多肽交联的ABP（RGD-AA）材料孔隙内hMSCs生长和增殖良好,并分泌ECM成份。表明AA处理联合RGD交联可以大大增强hMSCs黏附,提高细胞生长活性,同时hMSCs可以在材料内部顺利生长。说明AA处理联合RGD交联的ABP材料具有作为TEHV支架材料具有良好应用前景。结论:本实验进一步证实我们研究组过去应用的通过胰酶（2 h）+TritonX-100（高、低渗溶液各8 h）方法去细胞处理,可以完全去除新鲜牛心包内的细胞成份,并显著降低材料内可溶性蛋白,大大降低了材料的免疫原性;同时材料保持了良好的力学性能;牛心包材料具有力学的各向异性,其纤维走向对力学性能有明显影响,沿平行纤维走向的力学性能最强。乙酸处理可以明显提高去细胞牛心包材料的孔径及孔隙率,克服了以往生物材料低孔径、孔隙率的缺点,同时还保留了材料较好的机械性能。采用的密度梯度离心和贴壁分离法分离hMSCs,以10% FCS/DMEM培养体系培养,在多次传代后hMSCs增殖能力强,细胞形态趋于一致,表型稳定。我们首先应用RGD多肽通过EDC/NHS法大量牢固结合于去细胞牛心包表面,实验表明,RGD可以明显增强hMSCs的黏附及增殖,细胞骨架合成增多。体外种植实验表明hMSCs细胞在RGD交联的ABP支架材料中,能保持良好的功能活性,短期内迅速增殖,与支架材料有较强的亲和性,为进一步构建具有功能活性的TEHV奠定了良好的基础。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 去细胞牛心包制备及鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验二 RGD 交联改良去细胞牛心包支架材料制备及鉴定
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 MSCs 体外培养、鉴定及胶原黏附实验
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验四 RGD 修饰改良ABP 支架材料体外细胞种植实验
• 1 材料
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 个人简历和研究成果
• 致谢