靶向ICP4的RNA干扰对HSV-1病毒复制能力影响

论文摘要

单纯疱疹病毒1型（HSV-1）为双链包膜DNA病毒,具有亲神经的特性,在人群中感染广泛。HSV-1感染外周神经后可逆行跨越神经元进入中枢神经系统并建立潜伏感染,病毒裂解后引起中枢神经系统严重损伤。HSV-1基因组表达有很高时序性,分即早基因（IE）,早期基因（E）和晚期基因（L）。作为IE基因产物之一的即早蛋白ICP4可刺激E基因表达和DNA合成,诱导L基因的表达,是HSV-1基因表达从而引发感染的关键激活因子。因此,有效抑制ICP4的表达可以通过阻止HSV-1的复制达到治疗HSV-1感染性疾病的目的。RNA干扰（RNAi）是一种细胞本身固有的对抗外源基因侵犯的自我保护现象,双链RNA（dsRNA）分子在mRNA水平关闭相应序列及基因的表达使其沉默。在此基础上建立的RNAi技术不仅仅是一种经济、快捷、高效的抑制基因表达的技术手段,更为研究者在基因功能测定和基因治疗等方面开辟了新思路。本实验构建表达ICP4 siRNA （小干扰RNA）的重组真核慢病毒质粒PLKO.1-puro-ICP4-siRNA,将产生的重组病毒颗粒感染Vero细胞,建立稳定表达ICP4 siRNA的重组Vero-ICP4-siRNA细胞系；进一步探讨干扰HSV-1 ICP4基因后对HSV-1复制能力的影响,为临床上运用RNAi治疗HSV-1感染性疾病提供思路和实验依据。目的：1建立稳定表达ICP4特异性siRNA的重组细胞系。2初步分析靶向ICP4的siRNA对HSV-1在Vero细胞中复制能力的影响。方法：1基因工程技术构建重组慢病毒质粒PLKO.1-puro-ICP4-siRNA,双酶切及测序鉴定。2三质粒共转染293T细胞产生重组慢病毒颗粒。3重组病毒颗粒感染Vero细胞,嘌呤霉素筛选法建立ICP4-siRNA表达阳性的重组细胞系。4采用Realtime PCR和Western blot鉴定重组Vero-ICP4-siRNA细胞系。5通过观察HSV感染重组Vero细胞后CPE（细胞病变效应）表达和TCID50（半数组织培养感染剂量）法测定HSV-1滴度,检测靶向ICP4的siRNAs对HSV-1病毒复制能力的影响。结果：1成功构建重组真核慢病毒质粒PLKO.1-puro-ICP4-siRNA。2获得有效浓度的稳定表达ICP4的siRNAs的重组慢病毒颗粒。3成功建立稳定表达ICP4特异性siRNA的重组细胞系。4在mRNA和蛋白水平证实重组Vero-ICP4-siRNA细胞中的HSV-1 ICP4表达被抑制。5感染野生型HSV-1后,siRNA组Vero细胞的CPE表达率与阴性对照组比较有明显降低。进一步采用TCID50法测定病毒滴度并对TCID值进行AVONA统计学分析发现,siRNA组HSV滴度与对照组存在显著差异（P<0.001）, siRNA组低于对照组；且针对两个靶点的siRNA联合组HSV-1病毒滴度低于任何单一抑制组（P<0.001）。结论：1成功建立稳定表达抗ICP4 siRNA的重组Vero细胞系。2 SiRNA能够有效地干扰HSV-1 ICP4基因表达,且不同位点联合干扰对HSV-1 ICP4基因的表达有协同的抑制效果,进而对HSV-1病毒复制有协同抑制效果。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 图和附表清单
• 缩略词表
• 靶向ICP4的RNA干扰对HSV-1病毒复制能力的影响
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 综述:RNA干扰技术及其在抗病毒方面的应用
• 参考文献
• 个人简历 在学期间发表的学术论文与研究成果
• 致谢