论文摘要
MicroRNA（miRNA）是一类内源性的长度在22个核苷酸左右的非编码小分子RNA,它们广泛存在于真核生物基因组中。它们可以通过与序列互补的靶基因mRNA结合,从而在转录后水平对靶基因进行训控。研究表明,它们在动植物的生长发育、细胞分化与增殖、细胞死亡及肿瘤治疗等多种领域发挥着重要的调控作用。随着对miRNA的研究深入,越来越多的证据表明,miRNA在动物睾丸的发育成熟、各种细胞的功能分化以及精子发生发挥着重要的作用。但目前miRNA通过对关键基因转录后调控,而介导精子性状形成的遗传机制报道却很有限,有关猪miRNA信息和报道更少。因而,猪睾丸组织miRNA分离鉴定及功能研究,是一个值得探讨的新课题。本研究主要采用生物信息学和比较基因组学策略,克隆获得部分睾丸组织中表达的miRNAs,开展了靶基因预测、阶段性表达变化规律及构建表达载体等方面的工作,取得如下研究结果:1.miRNA的分离鉴定及生物信息学分析选择大白猪35d、60d、90d、180d不同发育时期睾丸组织作为研究材料,根据人和小鼠睾丸组织中已见报道的miRNA,结合miRbase上已经预测的猪源miRNA信息筛选研究目标miRNA基因,克隆测序共获得10个在大白猪睾丸组织中表达的miRNAs及其序列信息,通过RNAhybrid和RNA22算法预测得到let-7c可能的靶基因SPAM-1,miR-20可能的靶基因AQN-1,miR-29b、miR-34b和miR-136可能共同的靶基因HAS3,miR-145可能的靶基因RNF4,miR-136可能的靶基因ELSPBP1及SMCP等,将这些miRNA与已报道在猪睾丸组织或与精子发生相关的基因之间建立初步联系。2.克隆所得部分miRNA在大白猪不同发育时期睾丸组织中的表达分析利用RT-PCR方法检测pri-miRNAs在大白猪35d、60d、90d、180d不同发育时期睾丸组织的表达情况,并对total RNA进行加尾处理,应用qRT-PCR的方法检测miRNAs在这4个时期中的表达差异。分析let-7c、miR-20、miR-23a、miR-145的初始转录物和成熟miRNAs的结果发现这两者的表达水平不一致,进一步分析qRT-PCR结果发现其中miR-20呈下调趋势（p＜0.01）,miR-23a在前三个时期的表达模式呈上调趋势（p＜0.01）。3.大白猪睾丸组织4个miRNAs表达载体的构建扩增pri-miRNA片段,插入到真核表达载体pcDNA3.1（+）以构建miRNA表达载体,并将构建得到plet-7c、pmiR-20、pmiR-23a、pmiR-1224个miRNAs表达载体进行ST细胞转染实验,应用qRT-PCR方法进行表达验证,获得相应的过表达信息,结果表明其可用于miRNA功能的筛选和研究。