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【摘要】目的:对临床常用的3种口腔医用合金（镍铬合金、金合金、钴铬合金），通过流式细胞术来评价3种合金对L929细胞凋亡的影响。方法制备3种合金材料的浸提液,用浸提液培养L929细胞24h,用AnnexinV-EGFP与PI对L929细胞双染，应用流式细胞技术检测L929细胞的凋亡情况。结果3种材料引起细胞凋亡的顺序由小到大依次是金合金＞钴铬合金＞镍铬合金。结论不同医用口腔合金材料引起L929细胞凋亡表现出差异性,镍铬合金对L929细胞凋亡影响较大，金合金、钴铬合金表现出了良好的生物相容性。
【关键词】合金；细胞凋亡；生物相容性
【中图分类号】R352【文献标识码】B【文章编号】1005-0515(2011)05-0014-02
本实验对国内常用的几种医用口腔铸造合金进行了浸提液的制备，与L929细胞联合培养，用AnnexinV-EGFP/PI对L929细胞进行双染，从细胞凋亡方面对L929细胞做了检测和分析，比较了3中不同铸造合金之间的生物相容性，为其在临床中的应用提供了一定依据。
1材料与方法
1.1材料和试剂:小鼠成纤维细胞由中国医科大学附属口腔医院中心实验室提供。RPMI-1640培养液(Serva,Germmany)其中含纯牛胎血清，青霉素100μg/ml,链霉素100μg/ml，24孔培养板，50cm2培养瓶，CO2培养箱(Heraeus,德国),超净台(苏净集团安泰公司),高速离心机(Sorvall公司，美国)，流式细胞仪（BD公司，美国），AnnexinV-EGFP/PI试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。
1.2实验样品的分组:对照组,空白组。实验组，钴铬合金组（Stellite,上海），金合金组（Heraeus,德国），镍铬合金组(Stellite,上海)。金属材料成分见表1。
表1金属材料成分
1.3金属试件制备制作半径5mm、厚1mm的圆形蜡片（面积1.88cm2），根据不同合金的要求铸造形成圆形金属片，打磨抛光后超声清洗15分钟；去离子水冲洗数遍（大于3遍）后置于玻璃小瓶中，将金属片于121℃高压灭菌后待用。
1.4实验方法:
1.4.1浸提液制备无菌下将各金属圆片置于24孔板中，每孔1金属片加2ml含10％胎牛血清RPMI1640培养液，同时设立阴性对照，在37℃、5％CO2条件下连续浸提72小时后待用。
1.4.2细胞培养及细胞传代：L929细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640细胞培养基于50ml培养瓶中在37℃、5％的CO2培养箱中培养。约3～4天进行细胞传代。当培养细胞密度约70～80％时传代。弃培养瓶中培养液，加0.25％胰酶中和残余培养液后倒掉胰酶，再次加少量胰酶消化贴壁细胞2～3分钟，向培养瓶中加10ml培养液并轻轻吹打瓶壁使细胞脱落，按1：3比例传代培养于50ml培养瓶中。
1.4.3凋亡检测待培养细胞密度约30～40％时将各材料浸提液（包括阴性对照）各4ml加于培养瓶中，37℃、5%CO2条件下培养细胞24h后将培养瓶中的培养液移入离心管；加lml胰酶中和剩余培养液后移入离心管；加少量胰酶消化2～3分钟；培养瓶中加PBS5ml并用滴管轻轻吹打瓶壁使细胞脱落；将细胞悬液移入离心管；4℃、1000转离心5分钟；弃上清后加10mlPBS重悬；计数细胞并取1x106个细胞移入EP管。将500μLBindingBuffer加入Ep管重悬细胞；避光下加5μLAnnexinV-EGFP轻轻混匀;加5μLPI并轻轻混匀；室温下避光15分钟后上机检查。
1.5统计学分析所有计量资料以均数±标准差表示，使用SPSS13.0统计软件对结果进行统计学分析。采用单因素方差分析进行统计学分析。
2结果
2.1细胞凋亡检测结果:从流式细胞仪检测的数据中可以的得出，阴性对照组细胞凋亡率最低，其他依次其他组别为：金合金、钴铬合金、镍铬合金。镍铬合金组表现的生物相容性最差。见表3。
表2细胞凋亡率
总体均数P＜0.05，与阴性对照组相比，金合金P＞0.05，钴铬合金P＜0.05，镍铬合金P＜0.05。其中，金合金和钴铬合金P＞0.05，金合金和镍铬合金P＜0.05，钴铬合金和镍铬合金P＜0.05。
3讨论
目的金属合金作为口腔修复材料应用于人体内,在人体生理环境中使用,对生命有机体会产生一定的作用和影响。生物相容性评价是研究医用金属材料生物性能的重要内容之一,目前新材料在用于人体之前都要求必须经过全面的生物相容性检测。细胞凋亡可以被很多因素(包括许多已经广泛使用的生物材料)诱导产生，并且细胞凋亡与很多疾病发病机制和治疗关系密切，由此可以认为探索生物材料诱导的细胞凋亡对于生物材料的研制和应用也是极其重要的。如何快速准确地评价材料的生物相容性,对于研制新材料和缩短研制周期起着重要的作用[1]。
流式细胞仪能通过一个细胞测量其参数并且可进行多信息分析，如今已广泛应用于免疫学，细胞遗传学，生物化学和和肿瘤学、血液学等领域[2]。流式细胞仪（flowcytometer，FCM）能对细胞周期以及凋亡率进行快速准确的分析，是检测细胞功能状态的有效方法之一。因此利用FCM检测，可以完成对材料生物相容性的评价。
细胞凋亡（apotosis）是一个细胞自我破坏的程序性生化过程，通常需要30～60min。是多细胞生物体内的一个重要生命现象，即出现在个体发育过程中，也出现在正常生理状态或疾病中，在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束生命的过程，最后细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬。根据细胞凋亡发生的过程,细胞凋亡分为两种途径,即线粒体途径和死亡受体途径,两种途径互相影响,最终作用于caspase效应因子(即caspase3、7),从而引发级联效应,使染色体DNA降解成小细胞解体[3]。流式细胞仪检测凋亡分为形态学、生化学和分子生物学三个水平，应用前向散射光和侧向散射光，根据细胞的大小和密度的改变来检测凋亡；还可根据细胞凋亡的特征（如：DNA的断裂，膜成分的改变，脂质结构的疏松，肌动蛋白的丢失和磷脂成分的翻转）用适当的荧光探针来定量检测其凋亡细胞的数量。本实验正是利用胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，AnnexinV与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合，同时利用碘化丙啶对凋亡中晚期的细胞和死细胞染色，对凋亡细胞进行检测。ColiM等[4]通过线粒体的功能活动，坏死，凋亡和炎症因子的产生研究了体外铜铝镍形状记忆合金快速凝固薄带对大鼠腹腔巨噬细胞的反应。研究发现铜铝镍形状记忆合金快速凝固薄带相对于控制组，既不引起大鼠腹腔巨噬细胞的坏死，也不引起凋亡，与控制组相比更耐腐蚀性，可以提高其生物相容性。FeyerabendF等[5]在稀土元素改善生物应用可降解镁合金的性能的研究中，对钇、钕、镝、镨等稀土元素对人成骨肉瘤细胞株MG63活性的影响，血管周围人的脐带（HUCPV）细胞和巨噬细胞（RAW264.7）测定，以及诱导细胞凋亡和炎症因子（肿瘤坏死因子-α和IL-1α的表达）研究发现，镧和铈的元素的毒性最高，钆和镝更适合镁合金在生物学中的应用。
在临床应用的合金中，生物相容性好的合金材料一直为首选，但是由于合金本身的一些条件，并不是适合应用于所有的临床病例类型。在本实验中，金合金表现出良好的生物相容性，钴铬合金较好，镍铬合金对凋亡的影响较大。为临床中合金的使用提供了一定的依据。关于合金中具体的金属离子及其浓度作用于L929细胞的机制及更长时间的实验的研究观察以及更加全面的生物相容性的实验研究分析尚待进一步的实验分析。参考文献
[1]HarmandMF.InvitrostudyofbiodegradationofaCo-Cralloyusingahumancellculturemodel.JBiomaterSciPolymEd，1995,6(9):809-814
[2]张雁.关于牙科材料细胞毒性评定方法的进展.上海生物医学,1998,19（3）:32－36
[3]BenedictMA,HuY,InoharaN,etal.ExpressionandfunctionalanalysisofApaf-1isoforms.ExtraWd-40repeatisrequiredforcytochromecbindingandregulatedactivationofprocaspase-9.JBiolChem.2000，275(12):8461-8468
[4]Coli?M,Tomi?S,RudolfR,etal.TheresponseofmacrophagestoaCu-Al-Nishapememoryalloy.JBiomaterAppl，2010,25(3):269-286
[5]FeyerabendF,FischerJ,HoltzJ,etal.Evaluationofshort-termeffectsofrareearthandotherelementsusedinmagnesiumalloysonprimarycellsandcelllines.ActaBiomater，2010,6(5):1834-1842
作者单位：110000沈阳铁西唯爱口腔门诊部1
110000沈阳军区总医院口腔门诊2
110002中国医科大学口腔医学院材料教研室2