论文摘要
硝酸甘油是一种经典的抗心绞痛药物，其舒血管效应是通过释放一氧化氮（NO），直接激活鸟苷酸环化酶（sGC）使组织细胞中第二信使环磷酸鸟苷（cGMP）生成增加所介导。然而，长期或反复使用硝酸甘油可产生耐受性，表现为其舒血管效应减弱，其耐受产生的机制尚未完全阐明。近期研究显示耐受可能与氧化应激介导的硝酸甘油生物转化关键酶—线粒体醛脱氢酶（ALDH-2）活性下降有关。近来研究发现长期给予硝酸甘油能导致血管内皮功能障碍（endothelial dvsfunction，ED），其机制被认为与长期硝酸甘油处理造成内源性一氧化氮合酶（NOS）功能障碍，NO生成减少有关。最近研究显示，NOS抑制物非对称性二甲基精氨酸（ADMA）能竞争性抑制NOS活性，减少NO的生成和抑制内皮依赖性的血管舒张反应。在多种病理生理的情况下ADMA水平显著升高，并且能导致这些状况下的血管内皮功能不全，故被认为是一个新的内皮功能不全的预测因子。因此，我们推测ADMA在硝酸甘油耐受所致内皮功能不全以及硝酸甘油耐受形成中发挥一定作用。ADMA在体内主要经二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）水解。研究证明，DDAH活性下降所致的ADMA代谢减少是多种心血管疾病ADMA升高的主要原因。DDAH存在两个亚型：DDAH1和DDAH2，其中DDAH2主要分布于表达内皮型NOS（eNOS）的组织包括血管内皮。研究表明DDAH活性部位除可被氧化修饰调节外，还可被NO供体硝基化修饰调节，从而失去活性导致ADMA浓度积累增高。故本实验研究硝酸甘油耐受是否与DDAH活性下降和ADMA升高有关，并在此基础上进一步探讨其作用机制。（口山）酮是普遍存在于植物中的一类多酚类化合物。研究显示，一些（口山）酮化合物具明显的抗氧化、抗炎及心脏保护作用。然而，（口山）酮对硝酸甘油耐受是否具有逆转作用，尚未见报道。3，4，5，6-四羟基（口山）酮是我院药物化学系合成的新型（口山）酮单体化合物。本实验研究3，4，5，6-四羟基（口山）酮对硝酸甘油耐受是否具有逆转作用，并在此基础上进一步探讨其逆转作用的机制。该实验分为二个部分：1)研究血管内皮细胞DDAH／ADMA系统在硝酸甘油耐受形成中的作用，并探讨其机制；2)研究（口山）酮对硝酸甘油耐受是否具有逆转作用，并探讨其作用是否与DDAH／ADMA系统有关。方法硝酸甘油耐受模型制备：在体大鼠硝酸甘油耐受经皮下给予硝酸甘油（10mg／kg）每天三次，连续八天诱导形成，离体大鼠血管硝酸甘油耐受由预先于浴槽中加入硝酸甘油（10μM）30分钟诱导形成，离体培养血管内皮细胞硝酸甘油耐受由含硝酸甘油（10μM）的培基孵育16小时诱导形成，分别观察硝酸甘油舒血管效应、降压作用以及细胞内cGMP水平变化。高表达DDAH2质粒内皮细胞的制备。观察细胞内cGMP水平变化；测定培养液中ADMA浓度（高效液相色谱法）；测定内皮细胞内DDAH的活性；检测cGMP含量（放免法），测定ROS水平（荧光分光光度法），检测内皮细胞内ALDH-2的活性（分光度法）。结果第一节血管内皮细胞DDAH／ADMA系统介导硝酸甘油耐受（1）在体大鼠，硝酸甘油产生降压效应，连续给予硝酸甘油（10mg／kg）8天后其降压作用显著减弱，血浆ADMA浓度也显著增高，预先罐胃给予L-精氨酸（200mg／kg）可恢复硝酸甘油的降压效应。（2）离体胸主动脉，硝酸甘油引起浓度依赖性血管舒张，高浓度硝酸甘油（10μM）孵育血管环30min后其舒血管作用显著减弱，预先加入L-精氨酸（10mM）可恢复硝酸甘油的舒血管效应。（3）在培养血管内皮细胞，高浓度硝酸甘油（10μM）孵育内皮细胞16h后细胞内ROS水平显著升高，并伴有ALDH-2活性显著降低以及硝酸甘油促cGMP合成作用减弱；L-精氨酸（1mM）和N-乙酰半胱氨酸（10mM）可以恢复细胞内ROS、cGMP水平和ALDH活性。（4）外源性给予ADMA（1μM）可显著增加内皮细胞内的ROS水平。并显著降低ALDH活性。L-精氨酸（1mM）和N-乙酰半胱氨酸（10mM）可以恢复ROS水平和ALDH活性。（5）高表达DDAH2细胞能显著降低硝酸甘油耐受所诱的细胞内ROS水平升高和恢复细胞内ALDH活性。第二节（口山）酮对硝酸甘油耐受的逆转作用（1）在体大鼠，硝酸甘油产生降压效应，连续给予硝酸甘油（10mg／kg）8天后其降压作用显著减弱，血浆ADMA浓度也显著增高，预先罐胃给予（口山）酮（60或90mg／kg）可恢复硝酸甘油的降压效应。（2）离体胸主动脉，硝酸甘油引起浓度依赖性血管舒张，高浓度硝酸甘油（10μM）孵育血管环30min后其舒血管作用显著减弱，预先加入（口山）酮（10或30μM）可恢复硝酸甘油的舒血管效应。（3）在培养血管内皮细胞，高浓度硝酸甘油（10μM）孵育内皮细胞16h后细胞内ROS水平显著升高，并伴有ALDH活性显著降低以及硝酸甘油促cGMP合成作用减弱；（口山）酮（3或10μM）可以恢复细胞内ROS、cGMP水平和ALDH活性。结论DDAH／ADMA系统与硝酸甘油耐受的形成有关。（口山）酮能逆转硝酸甘油耐受，其机制涉及DDAH／ADMA系统。
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