圆环病毒2型感染的流行病学分析及其突变体致病性

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovims type 2，PCV2）属于圆环病毒科，基因组全长为1768nt或1767nt，除ORF1和ORF2两大阅读框外，还潜在9个ORFs。ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，ORF2编码PCV2免疫相关的蛋白Cap。PCV2是引起PMWS的主要病原，主要表现为免疫系统的损伤，使感染猪处于严重免疫抑制状态。本课题主要进行了PCV2的血清流行病学，分子流行病学和基因组各阅读框的致病性等方面的研究。应用无PCV污染的PK-15细胞分离病毒，从浙江省境内11个地市分离获得10株PCV2病毒。分离的病毒株经超速密度梯度离心纯化后，电镜下可观察到直径17-20nm的病毒粒子；分离病毒株的核苷酸测序结果显示，所用分离株的基因组长度均为1767bp。应用IFA技术，对浙江省内11个不同地区104个规模化猪场2000-2004年期间的4，307个血清样本进行PCV2的血清学流行病学调查，通过对不同地区、年份、年龄和品种猪的血清学数据分析，结果显示，所检测浙江省猪场均存在PCV2感染，猪群PCV2感染率为68.10％，种猪感染的血清阳性率为66.88％，断奶后猪感染的血清阳性率为82.10％。长白种猪感染的血清阳性率为44.83％、长白仔猪PCV2感染的血清阳性率为64.28％，明显高于大约克和杜洛克的种猪和仔猪。PCV2感染的血清阳性率高的种猪和仔猪群，其PRRSV和PRV的抗体阳性率低。通过对未免疫PRRSV疫苗的猪场进行血清学调查发现，PCV2感染率高的猪群，其PRRSV的感染率也随之升高。这些结果说明PCV2在猪群中的感染非常普遍，不同品种猪对PCV2的易感性不同，PCV2的感染降低了猪群对疫苗的免疫应答，PCV2的感染增加了PRRSV感染水平。以IFA和IPMA技术，对2004-2005年2，352份人血清与2005年奶牛、鸡、鸭、和山羊血清进行PCV2相关抗体的血清学检测，在689份人血清中检测到PCV2相关抗体，PCV2相关抗体阳性率为29.3％，没有在奶牛、鸡、鸭、和山羊中检测到PCV2相关抗体的存在。数据分析表明：2005年人群中PCV2的阳性率显著高于2004年（p＜0.01）；不同地区PCV2相关抗体阳性率差异不显著性（p＞0.05）；40至49年龄段人群抗体阳性率最高（OR=1.390[95％CI，1.011-1.9101，p=0.042），女性的阳性率高于男性；PCV2相关抗体阳性率与HBV感染和ALT水平的升高不存在相关性。根据PCV2-HZ0201株序列设计引物，扩增HZ0201的全基因组和各ORF突变全基因组，构建PCV2-HZ0201正常、ORF3和ORF4双突变（PCV2-MF3／4）、ORF5至11单ORF突变（PCV2-MF5至11）等基因组的重组质粒；将实验室保存的PCV2-MF3和PCV2-MF4与本研究中构建重组质粒中的PCV2全基因酶切，环化后转染PK-15细胞，转染细胞进行连续6次传代。PCV2正常的感染性克隆、PCV2-MF3、MF4、MF5、MF9、MF10和MF11在转染后和传代后均能够用PCR和IFA检测到PCV2病毒的存在，测序分析显示突变位点仍然存在；TCID50测定结果显示与野毒株相比未见明显差异，而ORF3-ORF4、ORF6、ORF7和ORF8缺失后则不能检测到病毒抗原和核酸存在。这些结果表明，ORF3-ORF4、ORF6、ORF7和ORF8或其突变点可能与病毒的复制有关；而ORF5、ORF9、ORF10、和ORF11或其突变点与病毒的复制无关。将PCV2-HZ0201、正常感染性克隆（IC）及突变体（PCV2-MF3至5、PCV2-MF9-11），腹腔和鼻内接种8周龄BALB／c小鼠，研究突变后的PCV2对小鼠致病性变化。PCV2-HZ0201、IC、PCV2-MF3和PCV2-MF4组，在7-14天出现抗体，28天左右抗体水平最高，随后开始下降；PCV2-MF5、PCV2-MF9至11接种后14-21天出现抗体，35天左右抗体水平最高，随后开始下降。PCV2-HZ0201，IC，PCV2-MF4、PCV2-MF9和PCV2-MF10通过Caspase-3和Caspase-8途径诱导细胞凋亡，感染后21天脾脏凋亡细胞数显著上升，CD3+CD4+、CD4+CD8+和CD3+CD8+T淋巴细胞数量显著下降，病理切片可观察到淋巴细胞缺失和凋亡现象，并出现病毒血症；感染后42天有所恢复。PCV2-MF3和PCV2-MF5接种小鼠后未诱导脾脏内凋亡细胞水平升高，和CD3+CD4+、CD4+CD8+和CD3+CD8+T淋巴细胞数量显著降低，大部分小鼠切片未观察到明显病理变化和病毒血症。PCV2-MF11感染小鼠后21天未显著诱导脾脏细胞凋亡和降低CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞数量；但感染后42天显著降低CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞数量，并出现病毒血症和脾脏淋巴细胞缺失现象。以上结果表明，ORF3，ORF5和ORF11突变后部分的改变了PCV2的致病性，可能存在于PCV2基因组中，是构成致病力的一部分；而ORF9和ORF10突变后没有引起PCV2致病性发生明显变化，与PCV2的致病性无关，其存在的可能性很小。ORF4突变后造成了PCV2一定程度的降低，但不十分显著，或许其致病性的激活需要其他因素，如免疫刺激等，其存在性仍值得进一步探究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 猪圆环病毒2型研究进展
• 1.病原学研究
• 1.1 PCV2的发现
• 1.2 PCV2的形态和理化特性
• 1.3 PCV2的分类地位
• 1.4 PCV2的分子生物学特征
• 2.流行病学研究
• 2.1 PCV2流行情况及分布
• 2.2 易感动物
• 2.3 传播方式及途径
• 3.PCV2致病机理研究
• 3.1 PCV2导致免疫系统病理的变化
• 3.2 PCV2导致外周血淋巴细胞的变化
• 4.PCV2检测技术
• 4.1 PCR技术
• 4.2 原位杂交
• 4.3 间接免疫荧光实验
• 4.4 免疫过氧化物酶单层细胞实验
• 4.5 酶联免疫吸附实验
• 5.与PCV2相关猪病
• 5.1 断奶后仔猪多系统衰竭综合症
• 5.2 猪肾病与皮炎综合症
• 5.3 猪呼吸疾病综合症
• 5.4 母猪繁殖障碍
• 5.5 肉芽肿性肠炎
• 5.6 仔猪先天性震颤
• 6.TTV相关病毒
• 6.1 TTV相关病毒的发现及分类
• 6.2 TTV的基因组结构特征
• 6.3 TTV的复制与转录
• 6.4 TTV的致病性
• 6.5 TTV的流行病学及检测
• 6.6 猪TTV
• 6.7 PCV2与TTV的关系
• 第二部分 研究内容
• 第一章 PCV2分离和全基因组的克隆及序列分析
• 1.材料与方法
• 1.1 病料来源、细胞、载体与试剂
• 1.2 PCV2型病毒检测引物与全基因引物的设计
• 1.3 病料PCV2检测
• 1.4 PCV2病毒分离
• 50测定'>1.5 PCV2分离株TCID₅₀测定
• 1.6 病毒蔗糖密度梯度离心纯化与形态观察
• 1.7 分离毒株全基因组扩增
• 1.8 分离毒株全基因组的克隆与序列分析
• 2.结果
• 2.1 病料组织的PCR检测
• 2.2 病毒分离与毒力检测
• 2.3 病毒纯化与病毒形态
• 2.4 PCV2分离毒株全基因组的克隆与序列测定
• 2.5 PCV2分离毒株全基因组序列结构分析
• 2.6 不同年份浙江省分离毒株的突变位点分析
• 2.7 分离毒株的同源性与进化
• 2.8 ORF1核苷酸及推导氨基酸序列分析
• 2.9 ORF2核苷酸及推导氨基酸序列分析
• 2.10 ORF3核苷酸及推导氨基酸序列分析
• 3.讨论
• 第二章 PCV2在猪群中感染的血清流行病学调查
• 1.材料与方法
• 1.1 病毒、血清、细胞与试剂
• 1.2 猪血清样本收集
• 1.3 IFA试验
• 1.4 ELISA试验
• 1.5 统计分析
• 2.结果
• 2.1 猪场及猪群的PCV2阳性率
• 2.2 不同年龄段猪的PCV2感染
• 2.3 不同年份采集样品的PCV2抗体阳性率
• 2.4 浙江不同地区猪PCV2抗体阳性
• 2.5 猪的年龄、品种与PCV2血清阳性率
• 2.6 仔猪及种猪与PCV2血清阳性率
• 2.7 PCV2感染与PRV及PRRS疫苗免疫应答
• 2.8 同一猪群中PCV2感染与PRRSV感染相关性分析
• 3.讨论
• 第三章 人群及其他动物中PCV2相关抗体的血清学调查
• 1.材料与方法
• 1.1 病毒、细胞、血清与试剂
• 1.2 人血清样本的收集
• 1.3 奶牛、鸡、鸭和山羊血清样本的收集
• 1.4 IFA试验
• 1.5 IPMA试验
• 1.6 人TTV、TTMV和猪TTV基因序列的收集和序列分析
• 1.7 人血清间接ELISA方法的建立
• 1.8 血清样品检测
• 1.9 统计分析
• 2.结果
• 2.1 研究人群的人口统计学
• 2.2 PCV2在师生中流行情况
• 2.3 不同年份收集血清PCV2相关抗体阳性率
• 2.4 不同地区PCV2相关抗体阳性率
• 2.5 PCV2相关抗体阳性率与年龄、性别、地区、HBV和ALT
• 2.6 ALT和HBV检测结果
• 2.7 其他动物血清检测结果
• 2.8 人TTV、TTMV和猪TTV与PCV2的进化分析
• 2.9 间接ELISA最佳反应条件的优化
• 2.10 间接ELISA特异性敏感性试验
• 2.11 血清样品检测
• 3.讨论
• 第四章 PCV2感染性克隆及突变体的构建与体外复制能力研究
• 1.材料与方法
• 1.1 细胞、病毒与试剂
• 1.2 正常感染性克隆及突变体引物设计
• 1.3 病毒DNA模板制备
• 1.4 pMD18-T-PCV2重组质粒构建
• 1.5 单突变位点突变体的构建
• 1.6 双突变位点突变体的构建
• 1.7 DNA环化、细胞转染及检测
• 50测定'>1.8 感染性试验和TCID₅₀测定
• 2.结果
• 2.1 PCV2分子克隆载体构建及鉴定
• 2.2 突变体的构建及鉴定
• 2.3 正常感染性克隆及各ORF缺失突变体PK-15细胞转染结果
• 2.4 正常感染性克隆及突变体在PK-15细胞上的感染性和复制能力
• 3.讨论
• 第五章 PCV2感染性克隆及其突变体对BALB/C小鼠致病性研究
• 1.材料与方法
• 1.1 细胞、毒株、试验动物、试剂
• 1.2 攻毒试验
• 1.3 感染性克隆及突变体体内致病性和凋亡性测定方案
• 2.结果
• 2.1 各组间PCV2抗体消长规律
• 2.2 小鼠感染后PCV2病毒血症的检测结果
• 2.3 接种小鼠脾脏的组织病理学观察结果
• +、CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞测定结果'>2.4 CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺T淋巴细胞测定结果
• 2.5 鼠脾脏内细胞凋亡流式分析结果
• 2.6 脾脏细胞内凋亡途经的检测结果
• 3.讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 第三部分 附录
• 附录A 常用试剂及仪器
• 附录B 常用缓冲液及培养基配方
• 附录C 攻博期间发表或录用的学术论文
• 致谢