暗纹东方鲀种群遗传多样性研究

论文摘要

暗纹东方纯（Takifugu obscurus）俗称河纯,属硬骨鱼纲（Osteichthyes）鲀形目（Tetraodontiformes）（?）屯科（Tetraodontidae）东方纯属（Fugu）,是一种重要的洄游性鱼类。因其肉质细嫩,肉味腴美,营养丰富,享有“长江三鲜之一”的美誉。暗纹东方鲀是长江中一种具有重要经济价值的渔业资源,近年来,由于水环境污染和过度捕捞等原因,暗纹东方纯资源急剧下降,目前已不能形成渔汛,这必然会给暗纹东方纯种质资源产生不利的影响。本文采用了微卫星和序列相关扩增多态性两种分子标记,研究了1个暗纹东方纯长江捕捞群体、1个放流群体和2个养殖群体的遗传多样性状况及其遗传结构。论文主要研究结果如下：1.研究了红鳍东方纯微卫星标记对暗纹东方纯的适用性。利用16对红鳍东方鲀微卫星引物对暗纹东方鲀基因组DNA进行PCR扩增,并优化PCR条件,结果表明10对微卫星引物（占总数62.5%）能扩增出特异性条带,且都表现出多态性,可用于暗纹东方纯群体遗传多样性分析。2选用10对暗纹东方纯和10对经筛选的红鳍东方鲀微卫星引物,对4个暗纹东方纯群体（1个长江捕捞江群体,1个放流群体和2个养殖群体）进行了遗传多样性分析。结果显示,20对微卫星引物在4个群体中共扩增得到113个等位基因,等位基因数在2-10之间,平均每个位点得到5.65个等位基因。各个群体的平均等位基因数（A）为4.95-5.50,平均观测杂合度（Ho）为0.6867-0.7617、平均期望杂合度（He）为0.6530-0.7000、平均多态信息含（PIC）0.6013-0.6384。群体间遗传分化系数（Fst）为0.0406,基因流（Nm）值为5.9056,表明4个群体遗传分化程度微弱,存在一定程度的基因交流。4个群体间的遗传距离为0.0880-0.1519,采用UPGMA法对4个群体进行聚类分析,结果表明上海养殖群体单独聚为一类,其余3个群体聚为另一类。3.利用正交设计L16（45）对影响暗纹东方纯SRAP-PCR反应的5个因素（Mg2+、Taq酶、dNTPs、模板DNA、引物）在4个水平上进行正交组合,确立了暗纹东方鲀SRAP反应最佳体系：20μL的PCR体系中含有Mg2+1.5mmol/L、Taq酶0.5U、模板DNA75ng、dNTPs0.15mmol/L、引物0.2μmol/L。利用30个暗纹东方鲀样本对该体系进行验证,结果表明该体系稳定可靠。4.利用上述反应体系,从49对引物组合中筛选出18对扩增条带清晰、稳定的引物组合首次对4个暗纹东方纯群体进行了遗传多样性分析。共获得231个位点,其中多态位点数为156个,占总位点数百分比为67.53%。4个群体内多态位点比例为54.98%-58.87%,群体的Nei’s基因多样性指数（H）为0.1992-0.2005,群体Shannon多样性指数（I）为0.2953-0.3016,群体间基因流（Nm）为4.1291。长江捕捞群体的多态位点比例、基因多样性指数、Shannon多样性指数均略高于其它三个群体。采用UPGMA法对4个群体进行聚类分析显示,上海养殖群体单独聚为一类,其余3个群体聚为另一类。AMOVA结果表明遗传变异主要来源于群体内,占总遗传变异的87.40%。以上结果表明,4个暗纹东方鲀群体具有较高的遗传多样性,群体间相似性较大,并且存在一定的基因交流。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 暗纹东方鱿的研究概况
• 1.1 暗纹东方纯的分类地位,分布及外部形态特征
• 1.2 暗纹东方纯的生活习性
• 1.3 暗纹东方纯的繁殖习性
• 1.4 暗纹东方纯的苗种培育和人工养殖技术研究
• 1.5 暗纹东方纯的经济意义
• 1.6 暗纹东方纯分子遗传学研究
• 2 分子标记在鱼类遗传多样性研究中的应用
• 2.1 基于RFLP标记技术研究
• 2.2 基于RAPD标记技术研究
• 2.3 基于AFLP标记技术研究
• 2.4 基于SRAP标记技术研究
• 2.5 基于TRAP标记技术研究
• 2.6 基于线粒体DNA标记技术研究
• 2.7 基于SNP标记技术研究
• 3 微卫星分子标记及其在水产动物研究中的应用
• 3.1 微卫星（mieorsatellite）DNA的定义
• 3.2 微卫星分子标记的优点和缺点
• 3.3 微卫星序列的获得
• 3.3.1 利用近缘物种的微卫星序列
• 3.3.2 寻找已经发表的微卫星序列或引物
• 3.3.3 基因组文库测序法
• 3.3.4 富集微卫星分离法
• 3.4 微卫星在水产动物研究中的应用
• 3.4.1 遗传多样性和遗传结构分析
• 3.4.2 遗传图谱构建
• 3.4.3 数量性状定位
• 3.4.4 亲缘关系分析
• 3.4.5 进化方面的应用
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 红鳍东方纯微卫星标记对的暗纹东方纯适用性
• 1. 实验材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要仪器设备、试剂和配制方法
• 1.2.1 主要仪器设备
• 1.2.2 主要药品和试剂
• 1.2.3 主要试剂配制
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 基因组DNA的提取
• 1.3.2 基因组DNA电泳检测
• 1.3.3 微卫星引物筛选和PCR扩增
• 1.3.4 微卫星PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 1.3.5 银染检测
• 2 结果与分析
• 2.1 暗纹东方纯肌肉组织基因组DNA提取结果
• 2.2 微卫星引物筛选结果
• 3 讨论
• 第三章 暗纹东方纯4个群体的遗传多样性分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料来源
• 1.2 基因组DNA提取
• 1.3 微卫星引物合成
• 1.4 P C R扩增及产物电泳检测
• 1.5 数据处理
• 1.5.1 有效等位基因数（Effective number of alleles,Ne）
• 1.5.2 杂合度（Heterozygosity,H）
• 1.5.3 遗传相似系数（Genetic identity,I）
• 1.5.4 遗传距离（Genetic distance,D）
• 1.5.5 基因分化系数（Fixation index,Fst）
• 1.5.6 基因流（Gene flow,Nm）
• 1.5.7 Hardy—Weinberg平衡偏离指数
• 1.5.8 多态信息含量（Polymorphism Information Content,PIC）
• 2 结果与分析
• 2.1 微卫星PCR结果
• 2.2 遗传多样性分析
• 2.3 Hardy-Weinberg平衡分析
• 2.4 群体遗传结构分析
• 2.4.1 基因流和种群分化指数
• 2.4.2 遗传相似系数和遗传距离
• 2.4.3 聚类分析
• 3 讨论
• 3.1 引物适用性
• 3.2 群体遗传多样性分析
• 3.3 群体Hadery-Weinberg平衡检测
• 3.4 群体间遗传结构分析
• 第四章 暗纹东方纯SRAP-PCR体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 基因组DNA提取
• 1.3 PCR反应
• 1.4 正交设计及优化体系的检验
• 2 结果与分析
• 2.1 正交试验结果及分析
• 2.2 因素内各水平对PCR结果的影响
• 2+浓度对PCR结果的影响'>2.2.1 Mg²⁺浓度对PCR结果的影响
• 2.2.2 Taq酶用量对PCR结果的影响
• 2.2.3 模板DNA含量对PCR结果的影响
• 2.2.4 dNTPs浓度对PCR结果的影响
• 2.2.5 引物浓度对PCR结果的影响
• 2.3 体系验证
• 3 讨论
• 第五章 利用SRAP标记研究暗纹东方纯群体4个群体的遗传多样性
• 1 实验材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 基因组DNA提取
• 1.3 SRAP-PCR反应
• 1.4 电泳检测
• 1.5 数据处理与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 SRAP引物筛选和扩增图谱
• 2.2 群体遗传多样性分析
• 2.3 群体变异分析
• 2.4 遗传距离和聚类分析
• 3 讨论
• 3.1 SRAP技术在暗纹东方纯种质资源研究中的可靠性
• 3.2 遗传多样性水平
• 3.3 群体遗传分化分析
• 3.4 遗传多样性保护与利用
• 3.5 SSR和SRAP两种分子标记结果的比较
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录