吲哚胺2，3双加氧酶在胃癌免疫中作用的初步研究

论文摘要

目的：研究胃癌组织中吲哚胺2,3-双加氧酶（Indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO）的表达情况和CDllc+树突状细胞（CD11c+DC）的分布情况,探讨胃癌组织中IDO的表达、CD11c+DC的分布与患者临床病理特征的关系及其对预后的指导意义。构建IDO真核表达载体pIRES2-EGFP-IDO,转染树突状细胞（IDO-DC）,考察体外IDO-DC对异体反应性T细胞增殖的影响。方法：1选取2001年1月至2007年6月天津医科大学附属肿瘤医院65例手术治疗胃癌患者的组织蜡块,免疫组织化学法检测IDO的表达情况、CD11c+DC的分布情况,观察IDO的表达、CD11c+DC的分布与临床病理特征的关系及其对预后的指导意义。2钓取IDO基因编码序列（CDS）区域,克隆至pMD 19-T simple载体中,测序验证后连入真核表达载体pIRES-EGFP,构建pIRES-EGFP-IDO重组质粒。将IDO真核表达载体pIRES-EGFP-IDO电转染至胃癌患者外周血单核细胞来源DC,构建表达IDO的DC,RT-PCR检测IDO基因的mRNA的表达,Western blot检测IDO基因的表达,氨基酸分析仪测定IDO蛋白的酶活性。3分选并纯化异体胃癌患者外周血CD3+T细胞,将其与IDO-DC共孵育,以转染空质粒组和未进行转染的DC为对照。检测体外IDO对异体反应性T细胞增殖的影响。结果：1免疫组化结果显示：胃癌组织和正常胃黏膜组织中IDO阳性表达率分别为47.7%（31/65）和22.7%（5/22）,统计学分析显示,胃癌组织中IDO阳性表达率显著高于正常胃黏膜组织（X2=4.223,P=0.040）。胃癌组织中IDO的表达与胃癌患者的TNM分期、肿瘤直径、病理类型及淋巴结转移具有显著正相关。2免疫组化结果显示：胃癌组织中CD11c+DC浸润的数量为23.28±10.34,正常胃黏膜组织中CD11c+DC浸润的数量为28.75±5.78,统计学分析显示,胃癌组织中CD11c+DC的数量显著低于正常胃黏膜组织（t=2.568,P=0.043）。胃癌组织中CD11c+DC的数量与胃癌患者的TNM分期、病理类型及淋巴结转移具有显著负相关。3预后分析显示,淋巴结转移、TNM分期、肿瘤直径、T分期、CD11c+DC数量和IDO的表达情况是胃癌患者预后的影响因素。进一步多因素分析显示,TNM分期和IDO的表达情况是胃癌患者预后的独立影响因素。4检测未转染DC、转染空质粒组和IDO-DC组的IDO mRNA的表达,IDO/β-actin灰度值之比分别为（0.1183+0.0602）、（0.1190±0.0547）和（0.5627±0.1414）, IDO-DC组灰度值明显高于另外两组（F=29.638, P<0.001）. Western blot检测IDO-DC中IDO蛋白的表达情况,可检测到相对分子量约为42KD的蛋白质,提示外源性IDO基因在IDO-DC成功表达。在IDO-DC组和未转染DC组的细胞培养上清液中色氨酸（Trp）浓度分别为（3.23±0.53）mg/L和（6.03+0.51）mg/L,差异有统计学意义（t=13.32,P<0.001）；犬尿氨酸（Kyn）浓度分别为（4.84±0.11）mg/L和（1.83±0.10）mg/L,差异有统计学意义（t=42.916,P<0.001）,提示IDO-DC表达的IDO具有完整的酶活性。5未转染组、转染空质粒组及IDO-DC组对异体反应性T细胞增殖影响的差异具统计学意义（F=4.595,P=0.042）。与转染空质粒、DC组比铰IDO-DC对异体反应性T细胞具有明显抑制活性（P<0.05）结论：1胃癌组织中IDO的表达显著高于正常胃黏膜组织.胃癌组织中CD11c+DC的数量显著低于正常胃黏膜组织。胃癌组织中IDO的表达水平与TNM分期、病理类型、肿瘤直径、淋巴结转移具有相关性；CD11c+DC的分布与TNM分期、病理类型、淋巴结转移具有相关性,提示胃癌组织中IDO、CD11c+DC可能参与胃癌的进展、转移过程。2胃癌微环境中的IDO的表达水平是独立预后影响因素,可作为判断患者预后的指标。3成功构建了IDO重组真核表达载体pIRES-EGFP-IDO,并成功转染了DC。IDO的活性表达可导致微环境中色氨酸耗竭,并产生其分解代谢产物,如犬尿氨酸等衍生物。4体外实验证实DC上IDO可以抑制异体反应性T淋巴细胞的增殖过程,这提示IDO可能通过抑制抗原特异性T淋巴细胞的增殖,从而影响了机体局部免疫反应。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 缩略语/符号说明
• 前言
• 研究现状、成果
• 研究目的、方法
• +DC在胃癌组织中的表达及意义'>一、IDO、CD11c⁺DC在胃癌组织中的表达及意义
• 1.1 对象和方法
• 1.1.1 临床资料
• 1.1.2 实验材料
• 1.1.3 实验方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 IDO在胃癌及正常胃黏膜组织中的表达
• +DC在胃癌及正常胃黏膜组织中的分布'>1.2.2 CD11c⁺DC在胃癌及正常胃黏膜组织中的分布
• 1.2.3 胃癌组织中IDO的表达与临床病理的关系
• +DC的分布与临床病理的关系'>1.2.4 胃癌组织中CD11c⁺DC的分布与临床病理的关系
• +DC的分布与患者预后的关系'>1.2.5 胃癌组织中IDO的表达、CD11c⁺DC的分布与患者预后的关系
• 1.3 讨论
• 1.3.1 IDO的结构及功能
• 1.3.2 IDO与肿瘤
• 1.3.3 树突状细胞与肿瘤
• 1.3.4 IDO与树突状细胞在肿瘤免疫中的作用
• 1.4 小结
• 二、IDO基因诱导DC对胃癌患者T淋巴细胞增殖反应的影响
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 IDO编码序列的构建与鉴定
• 2.2.2 pIRES-EGFP-IDO真核表达载体的构建
• 2.2.3 IDO转染DC的建立和鉴定
• 2.2.4 RT-PCR检测基因转染DC中IDO基因的表达
• 2.2.5 Western blot检测外源性IDO蛋白的表达
• 2.2.6 氨基酸分析仪检测IDO活性
• 2.2.7 IDO转染DC对混合T淋巴细胞增殖反应的影响
• 2.3 讨论
• 2.3.1 构建IDO基因真核载体并转染胃癌患者外周血单核细胞来源的DC
• 2.3.2 IDO基因转染DC细胞对T淋巴细胞增殖反应的影响
• 2.4 小结
• 全文结论
• 论文创新点
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述
• 参考文献
• 致谢