腺相关病毒载体AAV-hVEGF165的构建及hVEGF165与TGFβ1对椎间盘纤维环细胞的生物学效应

论文摘要

目的:构建人血管内皮生长因子(human vascar endothelial growth factor,hVEGF165)腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体AAV-hVEGF165,并体外检测其在椎间盘纤维环细胞中的表达,以及观察AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1（transforming growth factor betal,TGFβ1）基因联合转染对纤维环细胞Ⅰ型胶原的生物学效应。探讨应用hVEGF165基因逆转椎间盘退变可行性。 方法:采用分子克隆技术,从pcDNA3（+）-hVEGF165质粒获得hVEGF165cDNA,并克隆至AAV包装质粒pSNAV上,构建成pSNAV-hVEGF165的AAV重组质粒,经酶切及测序鉴定正确,用脂质体介导pSNAV-hVEGF165转染HEK293细胞和血管内皮细胞（vascarendothelial cell,VEC）,荧光免疫组化方法检测 hVEGF165蛋白,并用MTT法测定hVEGF165对VEC增殖的影响。由本元正阳公司对鉴定正确的pSNAV-hVEGF165进行AAV-hVEGF165的包装。AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1联合转染原代培养的椎间盘纤维环细胞,Western blotting检测hVEGF165与TGFβ1的表达以及纤维环细胞Ⅰ型胶原表达量的变化。 结果:经酶切鉴定及基因测序证实AAV包装质粒pSNAV-hVEGF165构建完成,荧光免疫组化显示hVEGF165蛋白的表达,对照未见hVEGF165蛋白的表达,MTT法显示hVEGF165蛋白对VEC增殖有促进作用。本元正阳公司包装出具有生物学功能的AAV-hVEGF165,AAV-hVEGF165构建成功。Western blotting显示hVEGF165与TGFβ1在纤维环细胞中表达,AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1基因联合转染的纤维环细胞Ⅰ型胶原表达量明显比对照和单基因转染的细胞Ⅰ型胶原表达量多。 结论:构建的腺相关病毒载体AAV-hVEGF165可在体外表达,hVEGF165在体外能够协同TGFβ1促进纤维环细胞Ⅰ型胶原表达的增加,hVEGF165有可能基因逆转椎间盘的早期退变。

论文目录

• 前言
• 165的构建'>第一部分 AAV-hVEGF₁₆₅的构建
• 材料和方法
• 一、材料
• 1.质粒、细菌和细胞
• 2.实验仪器及试剂
• 二、方法
• 165基因的获取'>1.hVEGF₁₆₅基因的获取
• 165引物设计及合成'>1.1 hVEGF₁₆₅引物设计及合成
• 165'>1.2 聚合酶链反应（PCR）扩增hVEGF₁₆₅
• 165的大反应体系（200μ1）PCR反应产物的酶切与纯化'>1.3 hVEGF₁₆₅的大反应体系（200μ1）PCR反应产物的酶切与纯化
• 2.穿梭质粒pSNAV的获取和鉴定
• 2.1 大肠杆菌感受态的制备和pSNAV的转化
• 2.2 碱裂解法小量提取质粒pSNAV—用于酶切
• 2.3 pSNAV的酶切鉴定
• 2.4 碱裂解法大提pSNAV
• 2.5 pSNAV的酶切与纯化
• 165的构建及鉴定'>3.pSNAV-hVEGF₁₆₅的构建及鉴定
• 165片断的连接反应'>3.1 纯化后质粒pSNAV和hVEGF₁₆₅片断的连接反应
• 165的扩增'>3.2 连接产物pSNAV-hVEGF₁₆₅的扩增
• 4.人胚肾293细胞（HEK293）的培养
• 4.1 HEK293细胞的复苏
• 4.2 HEK293细胞的传代
• 4.3 HEK293细胞的计数
• 165转染HEK293细胞'>5.脂质体介导的pSNAV-hVEGF₁₆₅转染HEK293细胞
• 165的免疫荧光组化'>6.pSNAV-hVEGF₁₆₅的免疫荧光组化
• 7.血管内皮细胞（VEC）的培养
• 7.1 VEC的复苏
• 7.2 VEC的传代及计数
• 165蛋白活性'>8.MTT法测定hVEGF₁₆₅蛋白活性
• 165的包装'>9.AAV-hVEGF₁₆₅的包装
• 结果
• 165PCR扩增产物'>10.1 hVEGF₁₆₅PCR扩增产物
• 10.2 质粒pSNAV的酶切鉴定
• 165构建及鉴定'>10.3 pSNAV-VEGF₁₆₅构建及鉴定
• 10.4 HEK293细胞的培养
• 165转染后的HEK293细胞'>10.5 脂质体介导pSNAV-hVEGF₁₆₅转染后的HEK293细胞
• 165的免疫荧光组化'>10.6 pSNAV-hVEGF₁₆₅的免疫荧光组化
• 10.7 VEC的培养
• 165蛋白活性'>10.8 MTT法测定hVEGF₁₆₅蛋白活性
• 165的包装结果'>10.9 AAV-hVEGF₁₆₅的包装结果
• 165与TGFβ1对椎间盘纤维环细胞的生物学效应'>第二部分 hVEGF₁₆₅与TGFβ1对椎间盘纤维环细胞的生物学效应
• 材料和方法
• 一、材料
• 1.病毒载体和细胞
• 2.实验仪器及试剂
• 二、方法
• 1.兔椎间盘纤维环细胞的培养
• 2.ABC免疫组织化学鉴定兔椎间盘纤维环细胞
• 3.rAAV-EGFP转染兔纤维环细胞
• 165转染兔纤维环细胞及hVEGF₁₆₅表达的Western lotting鉴定'>4.rAAV-hVEGF₁₆₅转染兔纤维环细胞及hVEGF₁₆₅表达的Western lotting鉴定
• 165转染兔纤维环细胞'>4.1 rAAV-hVEGF₁₆₅转染兔纤维环细胞
• 165表达的Western blotting鉴定'>4.2 hVEGF₁₆₅表达的Western blotting鉴定
• 5.rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞及TGFβ1表达的Western blotting鉴定
• 5.1 rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞
• 5.2 TGFβ1蛋白表达的Western blotting鉴定
• 165、rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞及其Ⅰ型胶原表达量的Western blotting检测'>6.rAAV-hVEGF₁₆₅、rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞及其Ⅰ型胶原表达量的Western blotting检测
• 165、rAAV-TGFβ1转染兔椎间盘纤维环细胞'>6.1 rAAV-hVEGF₁₆₅、rAAV-TGFβ1转染兔椎间盘纤维环细胞
• 6.2 纤维环细胞胶原蛋白的的Western blotting检测
• 结果
• 7.1 兔椎间盘纤维环细胞的培养
• 7.2 ABC免疫组织化学鉴定兔椎间盘纤维环细胞
• 7.3 rAAV-EGFP转染兔纤维环细胞
• 165转染兔纤维环细胞及hVEGF₁₆₅表达的Western blotting鉴定'>7.4 rAAV-hVEGF₁₆₅转染兔纤维环细胞及hVEGF₁₆₅表达的Western blotting鉴定
• 7.5 rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞及TGFβ1表达的Western blotting鉴定
• 165、rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞及其Ⅰ型胶表达量的Western blotting检测'>7.6 rAAV-hVEGF₁₆₅、rAAV-TGFβ1转染兔纤维环细胞及其Ⅰ型胶表达量的Western blotting检测
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 综述参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 附录
• 致谢
• 版权声明