疟原虫抗原特异的CD4+T细胞免疫保护特异性研究

论文摘要

研究背景:疟疾目前仍然是严重威胁人类健康的寄生虫病,人们与这种疾病的斗争已进行了1个多世纪,但至今疟疾仍在全球肆虐。据2005年世界疟疾报告显示每年由于疟疾死亡的人数超过1百万,在107个国家超过32亿人面临疟疾感染的威胁,这其中又以儿童为高危人群。疟疾这单一的疾患对人类健康和经济造成的冲击和损害难以简单评估。研究安全有效控制疟疾的方法是科学家为之奋斗了60多年的课题。在过去的几十年里,尽管喹宁等药物在治疗疟疾方面作出了巨大的贡献,但近年来疟疾的发病率仍急剧上升,这表明疟原虫的耐药性日趋明显。研究者普遍认为,研制安全、价廉和有效的疟疾疫苗是人类控制乃至根除疟疾的重要途径。历史业已证实,控制传染病最有效且最经济的手段是预防接种传染病的疫苗。目前,发达国家投入使用的疫苗有12-13种,发展中国家有6-7种,这些疫苗的预防接种每年挽救了数百万人的生命。假如能成功地研制并应用艾滋病、结核、疟疾等疾病的疫苗,每年又将有成百万人的生命得以挽救。因此,世界各国对疟疾疫苗研究给予了前所未有的关注和支持。因疟原虫有非常复杂的生活史,虽然疟疾疫苗的研制已有半个世纪的历史,但目前关于疟疾疫苗方面的研究仍收效甚微。疫苗的研制仍然是当前医学研究者面临的最迫切最严峻的挑战之一。疟原虫在感染人体以后分两期发展,肝期（红外期）和红内期。因此有相对于肝期和红内期的疫苗研制。既往的研究主要集中于肝期疫苗,但红内期是致病的主要阶段,感染患者的临床症状及体征是红细胞感染期病理生理所致,所以研制红内期感染的疟原虫疫苗是目前最引人注目的研究方向。在红内期疫苗的研制过程中,目前已经鉴定并克隆了很多能有效诱导免疫保护的抗原,包含有MSP-1、MSP-2、RESA及AMA-1抗原的疫苗能够降低疟原虫密度,但是其多态性及同种细胞的抗原可变性使疫苗的研制复杂化。此外,实验证实由这类疫苗诱导的免疫保护必须依赖于高效价的抗体存在,且这些抗体的产生有赖于细胞免疫的介导。因此要获得真正有效的疟疾疫苗,不仅有赖于鉴定克隆能有效诱导免疫保护的抗原,还有赖于测定和评估抗原诱发的免疫保护机制。针对疟原虫的免疫反应机制非常复杂,尽管目前普遍认为在疟原虫的红内期免疫效应机制中,诱导产生特异性抗体的体液免疫仍发挥着主导作用,而最近的一些来自动物模型和流行病学的资料使我们对CD4+T细胞在红内期抗疟免疫反应中扮演的角色又有新的了解。一些实验研究发现,无论是通过天然感染疟原虫,还是通过亚单位疫苗诱导,体内生成的CD4+T细胞在保护性免疫反应中都扮演了重要的角色。将小鼠的CD4+T淋巴细胞去除,发现小鼠疟疾感染率显著升高。同样,给小鼠输入疟原虫特异性CD4+T淋巴细胞,小鼠的感染率则显著下降。B细胞敲除或B细胞缺陷小鼠在感染疟原虫后可产生细胞介导的保护性免疫,尽管不能完全清除原虫,但这种免疫力可将原虫密度控制在一个很低的水平。由此可推测CD4+T淋巴细胞可以非抗体依赖的方式发挥抗疟原虫感染的作用。并且活化的CD4+T细胞能辅助B细胞产生抗体,如用MSP1-19抗原蛋白免疫小鼠后,体内产生的保护性免疫反应主要依赖于高滴度的抗体,与此同时,在受到攻击后,B细胞持续合成抗体的能力必须得到CD4+T细胞的辅助。但特异性CD4+T淋巴细胞如何提呈抗原、如何杀伤病原体的关键分子和细胞学机制仍不明。成熟的红细胞不表达组织相容性抗原Ⅰ和Ⅱ,显然不能提呈疟原虫抗原。因此疟原虫抗原必定是在pRBC破碎以后被巨噬细胞等细胞吞噬后才得以提呈给特异性CD4+T淋巴细胞。而细胞杀伤过程始于T淋巴细胞与特定抗原决定簇结合后激活,活化后的T淋巴细胞分泌细胞因子或辅助B细胞分泌抗体来杀伤靶细胞。但活化后的疟原虫抗原CD4+T细胞如何施展其杀伤作用,其在杀伤疟原虫的过程中是否具有特异性,即其免疫保护是否能抗其它疟原虫感染等问题至今未明。本实验是利用其它疟原虫的特异性T淋巴细胞（如P.yoelii特异性CD4+T淋巴细胞）输入小鼠体内,然后用P.yoelii和P.berghei分别攻击这些小鼠,若特异性CD4+T淋巴细胞其杀伤疟原虫的机制是特异性的,则只能杀伤yoelii疟原虫,若berghei疟原虫感染率也能得到控制,则表明特异性CD4+T淋巴细胞可以发挥非特异性的杀伤作用。或用P.yoelii和GFP荧光蛋白标记的转基因P.berghei同时攻击这些小鼠。若是特异性杀伤,则只能杀伤P.yoelii。若荧光标记的P.berghei也同时被杀伤,也可表明疟原虫抗原特异性CD4+T淋巴细胞其杀伤疟原虫的机制具有非特异性,即存在了交叉保护现象,可以抗其它疟原虫感染。充分认识这一过程为今后是否可以选择性地使用有限抗原免疫来控制不同疟原虫感染提供了理论依据。研究目的:比较针对某疟原虫细胞免疫的疟原虫抗原特异性的CD4+T细胞在接受不同疟原虫攻击后,红细胞感染率的差别,从而判定抗原特异性的CD4+T在疟原虫杀伤机制中是否具有非特异性,即其免疫保护作用是否存在交叉性。研究方法:1、淋巴细胞体外增殖实验分析其它疟原虫抗原诱导抗原特异性CD4+T细胞的增殖情况;2、以P.yoelii抗原特异性CD4+T淋巴细胞和OVA蛋白特异性T细胞过继免疫后,P.berghei攻击,血涂片比较两组疟原虫感染率水平;3、荧光显微镜下检测红细胞内两种疟原虫方法的建立;4、以P.yoelii抗原特异性CD4+T淋巴细胞和OVA蛋白特异性T细胞过继免疫后,P.yoelii及GFP蛋白荧光标记的转基因P.berghei同时攻击,荧光显微镜法检测红细胞内两种疟原虫,比较两组中两种疟原虫各自的感染率水平。结果:1、建立各种疟原虫抗原特异的CD4+T淋巴细胞株,鉴定其功能和特异性;2、淋巴细胞体外增殖实验证实抗原P.berghei可以诱导P.yoelii抗原特异的CD4+T细胞出现明显的增殖现象,同时抗原P.yoelii也可以诱导P.berghei抗原特异的CD4+T细胞增殖;3、疟原虫抗原特异的CD4+T淋巴细胞株过继免疫小鼠后,以其它疟原虫攻击感染,次日起每日制备薄血膜镜检原虫率,结果提示同种疟原虫感染攻击的小鼠得到了免疫保护作用的同时,其它疟原虫感染攻击的小鼠相对于对照组其疟原虫感染率峰值也出现下降,并且延长了免疫小鼠的生存时间;4、P.yoelii抗原特异的CD4+T细胞株过继免疫小鼠后,以P.yoelii及荧光标记的转基因P.berghei同时攻击,荧光显微镜法检测两种疟原虫感染率,结果提示P.yoelii抗原特异的CD4+T细胞在杀伤P.yoelii的同时,也控制了P.berghei感染率的上升。结论:通过体外建立各种疟原虫抗原特异的CD4+T淋巴细胞株,进行了体外淋巴细胞增殖及过继免疫实验,结果提示疟原虫抗原特异性CD4+T细胞其免疫保护存在交叉性,充分认识这一过程为今后选择性地使用有限抗原免疫来控制不同疟原虫感染提供了理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略语
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 疟疾感染中CD4+T细胞的免疫作用机制研究进展
• 致谢