牛链球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

论文摘要

乳酸是一种重要的有机酸,广泛应用于食品、医药、制革、纺织、卷烟工业、化学工业、环保及农业等领域。利用L-乳酸生产新型聚酯材料聚乳酸（PLA）,具有优良的加工性能和生物可降解性,可用于消除“白色污染”保护环境引起了世界的关注。 目前,世界的乳酸年需求量以15%的速度递增。传统的乳酸生产方法中,化学合成法所用原料有剧毒,生产成本高:酶法生产乳酸工艺比较复杂,对生产条件要求较高,因此微生物发酵法生产乳酸成为乳酸生产的主要方法。 本论文以牛链球菌（Streptococcus bovis）总DNA为模板,PCR扩增Streptococcus bovis的L-（+）-乳酸脱氢酶基因（ldhL）,构建重组质粒pSE-ldhL,并在大肠杆菌JM109中表达。SDS-PAGE分析表明:有分子量约为36KD的特征蛋白条带出现。经紫外分光光度法测定,在重组菌株中能检测到L-（+）-乳酸脱氢酶活性,重组菌株的最高酶活力为168.2U/ml,高于对照菌的74.1U/ml的酶活。重组酶的最适反应温度范围为20℃～25℃,最适作用PH为5.0～5.5。经质粒稳定性的研究表明:重组质粒的稳定性达99.9%。 本研究还构建了置换型同源重组质粒pSE-ldhA-tetr,期望利用ldhA-tetr双链片段实现与菌株染色体上的ldhA基因进行同源双交换,获得D-（-）-乳

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 乳酸细菌
• 1.2 根霉
• 1.3 基因工程菌
• 1.4 本研究的目的及意义
• 第二章 L-（+）-乳酸脱氢酶基因（ldhL）在大肠杆菌中的表达
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 酶与试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 Streptococcus bovis的复苏培养
• 2.2.2 菌种的保存
• 2.2.3 Streptococcus bovis基因组总DNA的制备
• 2.2.4 L-（+）-乳酸脱氢酶基因（ldhL）的克隆和表达载体的构建
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.6 质粒DNA的大量制备
• 2.2.7 质粒DNA的小量制备
• 2.2.8 DNA的酶切与连接
• 2.2.9 连接产物化学转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.10 阳性克隆的筛选和酶切验证
• 2.2.11 重组子的质粒PCR验证
• 2.2.12 外源片段在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.2.13 表达产物的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.14 L-（+）-乳酸脱氧酶（LDH）活性的测定
• 2.2.15 重组L-（+）-乳酸脱氢酶（LDH）性质的研究
• 2.2.16 重组质粒pSE-ldhL稳定性的研究
• 2.3 结果和分析
• 2.3.1 L-（+）-乳酸脱氢酶基因（ldhL）表达质粒的构建
• 2.3.2 L-（+）-乳酸脱氢酶基因（ldhL）的不完全序列分析
• 2.3.3 表达产物的SDS-PAGE分析
• 2.3.4 重组LDH活力测定分析
• 2.3.5 重组LDH性质的分析
• 2.3.6 重组质粒pSE-lhdL稳定性的分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 质粒的稳定性
• 2.4.2 外源基因在大肠杆菌中的表达
• 第三章 大肠杆菌中D-（-）-乳酸脱氢酶基因（ldhA）敲除的研究
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株与质粒
• 3.1.2 酶与试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 方法与步骤
• 3.2.1 Escherichia coli基因组总DNA的制备
• 3.2.2 电穿孔大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.3 D-（-）-乳酸脱氢酶基因（ldhA）的引物设计和PCR扩增
• r）的引物设计和PCR扩增'>3.2.4 四环素抗性基因（tet^r）的引物设计和PCR扩增
• 3.2.5 DNA的酶切与连接
• 3.2.6 质粒DNA的转化
• 3.2.7 阳性克隆的筛选和酶切验证
• 3.2.8 重组质粒PCR验证
• 3.2.9 ldhA基因的置换DNA片段的制备
• 3.2.10 电转化大肠杆菌JM109感受态细胞
• 3.2.11 基因敲除菌株的初筛及PCR验证
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 ldhA基因的克隆
• r基因的克隆'>3.3.2 tet^r基因的克隆
• r的构建'>3.3.3 置换型同源重组质粒pSE-ldhA-tet^r的构建
• 3.4 讨论
• 第四章 结论与展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文