原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡的保护作用

论文摘要

本研究选用与多巴胺能神经元有许多相似特征的PC12细胞为实验对象，利用鱼藤酮诱导细胞凋亡，从而建立帕金森（PD）体外细胞模型。结果表明，应用鱼藤酮48小时后，细胞活力下降，细胞中的乳酸脱氢酶（LDH）漏出率增加；通过细胞核的形态观察以及流式细胞仪的分析，鱼藤酮使凋亡细胞比例显著增加，并且使Bcl-2蛋白表达量减少，Bax蛋白表达量升高，Bcl-2／Bax蛋白比率下降，符合线粒体凋亡通路的特征。在室温下，利用我们先前的分离提取工艺，从益智仁里的乙酸乙酯萃取相中得到一个活性单体化合物原儿茶酸（PCA），并探讨PCA在PC12细胞中的保护作用机制。LDH分析证明了PCA能够保护质膜的完整性而抑制鱼藤酮介导的LDH漏出；通过形态观察及流式细胞仪的分析，证实PCA可显著抑制细胞凋亡；另外，AnnexinV-PI双染的方法定量分析，发现PCA能够明显降低细胞凋亡／坏死细胞的比率。PCA是通过提高Bcl-2蛋白表达和线粒体膜电位（MMP），促进超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的激活，抑制活性氧（ROS）的产生和谷胱甘肽（GSH）的耗竭，拮抗半胱氨酸酶-3（caspase-3）的活性，达到抑制鱼藤酮介导的细胞凋亡的目的。这些结果表明：PCA可能是通过削弱线粒体功能失调而抑制其所致的细胞凋亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1.绪论
• 1.1 研究背景
• 1.2 选题依据
• 1.3 实验方案
• 1.4 研究目的及意义
• 参考文献
• 2.文献综述
• 2.1 细胞凋亡的信号通路
• 2.1.1 死亡受体通路
• 2.1.2 线粒体通路
• 2.1.3 内质网通路
• 2.2 线粒体功能异常与细胞凋亡
• 2.2.1 线粒体介导的凋亡通路
• 2.2.2 线粒体复合物Ⅰ的抑制与细胞凋亡
• 2.3 氧化应激,细胞凋亡与帕金森病
• 2.3.1 氧化应激与细胞凋亡
• 2.3.2 氧化应激与帕金森病
• 2.4 帕金森病模型的研究进展
• 2.4.1 外源性神经毒素诱导的细胞及动物帕金森病模型
• 2.4.2 帕金森病遗传及免疫损伤模型
• 2.5 中药益智仁及其有效成分原儿茶酸的研究进展
• 2.5.1 益智仁的化学成分
• 2.5.2 益智仁的药理作用
• 2.5.3 原儿茶酸的研究概况
• 参考文献
• 3 鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡模型的建立
• 3.1 实验材料与设备
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 PC12细胞的培养及药物处理
• 3.2.2 鱼藤酮对PC12细胞的损伤
• 3.2.3 胞内乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的检测
• 3.2.4 Hoechst 33258染色对PC12细胞形态学观察
• 3.2.5 流式细胞仪分析PC12细胞DNA含量
• 3.2.6 AnnexinV-PI双染检测PC12细胞凋亡与坏死
• 3.2.7 流式细胞仪分析Bcl-2家族蛋白
• 3.2.8 统计学处理
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 鱼藤酮引起的PC12细胞损伤的时间和剂量关系
• 3.3.2 鱼藤酮引起乳酸脱氢酶（LDH）的释放
• 3.3.3 Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡
• 3.3.4 流式细胞仪分析PC12细胞DNA的含量
• 3.3.5 流式细胞仪检测AV-PI双染的细胞凋亡与坏死
• 3.3.6 鱼藤酮对Bcl-2家族蛋白的影响
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 参考文献
• 4 原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡的保护作用机制的研究
• 4.1 实验材料与设备
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 实验药物的制备
• 4.2.2 PC12细胞的培养
• 4.2.3 原儿茶酸对PC12细胞的增殖作用
• 4.2.4 原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤的作用
• 4.2.5 胞内乳酸脱氢酶（LDH）的测定
• 4.2.6 Hoechst 33258染色对PC12的细胞形态学观察
• 4.2.7 流式细胞仪分析PC12细胞的DNA含量
• 4.2.8 AnnexinV-PI双染检测PC12细胞凋亡与坏死
• 4.2.9 流式细胞仪分析PC12细胞Bcl-2家族蛋白
• 4.2.10 胞内谷胱甘肽（GSH）含量的测定
• 4.2.11 胞内抗氧化酶（SOD,GSH-Px,CAT）的检测
• 4.2.12 胞内活性氧（ROS）的检测
• 4.2.13 Caspase-3活性分析
• 4.2.14 线粒体膜电位（MMP）的检测
• 4.2.15 蛋白质含量的测定
• 4.2.16 统计学处理
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 原儿茶酸对PC12细胞增殖作用的影响
• 4.3.2 原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞活力的影响
• 4.3.3 原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞的LDH漏出的影响
• 4.3.4 原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡的保护作用
• 4.3.5 原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞中Bcl-2家族蛋白表达的影响
• 4.3.6 原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞中GSH含量变化的影响
• 4.3.7 原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞中抗氧化酶活性变化的影响
• 4.3.8 原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞中ROS产生的影响
• 4.3.9 原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞中Caspase-3活性变化的影响
• 4.3.10 原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞中MMP变化的影响
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 参考文献
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 英文缩略语
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况
• 致谢